Pubblicato: 2023 | Ultima revisione: maggio 2026
Guida completa al congelamento delle cellule: garantire la vitalità e la sterilità
Il congelamento delle cellule è un processo fondamentale nella gestione delle colture cellulari, che garantisce la conservazione a lungo termine e la preservazione di preziose linee cellulari. Sia che si lavori con cellule umane o animali, seguire protocolli precisi e mantenere rigorose tecniche asettiche è fondamentale per ottenere una crioconservazione di successo.
Questa guida fornisce istruzioni dettagliate sui materiali e sui reagenti necessari, nonché sulle procedure passo passo per congelare efficacemente le cellule preservandone la vitalità e la sterilità. Attenendosi a queste linee guida, i ricercatori possono conservare con sicurezza le colture cellulari e successivamente riattivarle con una perdita minima di vitalità cellulare, mantenendo l’integrità e l’affidabilità dei risultati sperimentali.
Per iniziare, è essenziale creare un ambiente di lavoro sterile. Tecniche asettiche adeguate svolgono un ruolo cruciale nel prevenire la contaminazione e garantire la sterilità delle colture.
Tecnica asettica
Seguire le tecniche asettiche durante l'intero processo per garantire la sterilità delle colture.
Processo completo di congelamento delle cellule
Questo diagramma di flusso fornisce una guida visiva dettagliata alle fasi essenziali coinvolte nel corretto congelamento delle cellule. Seguire queste procedure per garantire un'elevata vitalità e integrità delle cellule durante il processo di crioconservazione.
Preparazione del mezzo di congelamento
Preparare il mezzo di congelamento crioprotettivo in base al tipo di cellula:
- Colture in terreni contenenti FBS: 90% FBS + 10% DMSO oppure 70% terreno di crescita, 20% FBS e 10% DMSO
- Cellule che richiedono glicerolo: 90% di FBS + 10% di glicerolo
Si consiglia di acquistare il nostro mezzo di congelamento preformulato:
- Mezzo di congelamento CM-1: per protocolli che richiedono un mezzo contenente siero fetale bovino (FBS)
- Terreno di congelamento CM-ACF - senza siero: per un'alternativa senza FBS
Etichettatura e documentazione
Etichettare le provette criogeniche con i seguenti dettagli:
- Data
- Nome del ricercatore
- Numero di cellule
- Numero di passaggio
- Tipo di cellula
- Eventuali informazioni aggiuntive (ad es. modificazioni genetiche)
Preparazione delle cellule
Per le cellule aderenti:
- Monitorare le cellule fino a quando non raggiungono una confluenza dell'85–95%
- Aspirare il vecchio terreno di coltura
- Risciacquare il monostrato cellulare con PBS privo di calcio e magnesio
- Staccare le cellule con Accutase, tripsina o tripsina-EDTA e neutralizzare con terreno di coltura se necessario
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta Falcon da 50 mL
Per le cellule in sospensione:
- Controllare la densità e lo stato di salute delle cellule al microscopio
- Trasferire la sospensione cellulare direttamente in una provetta Falcon da 50 mL
Conteggio cellulare e centrifugazione
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contacellule automatico
- Centrifugare a 300 g per 3-5 minuti a temperatura ambiente per ottenere un pellet cellulare
- Aspirare con cura il surnatante, evitando di disturbare il pellet cellulare
- Riscaldare il mezzo di congelamento preparato a 37 °C prima dell'uso
Crioconservazione
- Risospendere il pellet cellulare nel mezzo di congelamento fino a una densità di 2,0 milioni di cellule/mL per le cellule aderenti e di 5 milioni di cellule/mL per le cellule in sospensione, oppure alla concentrazione desiderata
- Dividere in aliquote da 1,0 mL (o più, se necessario) della sospensione cellulare in crioviali etichettati
- Utilizzare un metodo di congelamento lento prima di trasferire le cellule alla conservazione a lungo termine
- ? Metodo
- ? Passaggi
-
❄️
Congelamento manuale -
1️⃣ Mettere le cellule nel mezzo di congelamento in un congelatore a 4 °C per 40 minuti.
2️⃣ Trasferire in un congelatore a -80 °C per 24 ore.
3️⃣ Conservare le cellule in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. -
?
Utilizzo di Mr. Frosty -
1️⃣ Preparare le cellule in crioviali con mezzo di congelamento.
2️⃣ Collocare i crioviali nel contenitore Mr. Frosty.
3️⃣ Conservare a -80 °C per 24 ore prima di trasferire in azoto liquido. -
?
Congelatore a velocità controllata -
1️⃣ Programmare il dispositivo per abbassare gradualmente la temperatura.
2️⃣ Collocare le cellule preparate nel congelatore.
3️⃣ Al termine del ciclo di congelamento, trasferire le cellule nell'azoto liquido.
- Conservare le criovial a temperature inferiori a -130 °C o in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
Materiali e reagenti
- Crioviali da 1–2 mL
- Unità di congelamento CoolCell® o congelatore a velocità controllata
- Mezzo di congelamento crioprotettivo (ad es. mezzi crioprotettivi fai da te, CM-1, CM-ACF o mezzi specializzati)
- Siero fetale bovino (FBS) o terreni di coltura condizionati
- DMSO o glicerolo
- PBS privo di calcio e magnesio
- Accutase, tripsina o tripsina-EDTA (per cellule aderenti)
- Provette Falcon da 15 mL o 50 mL
- Emocitometro o contacellule automatico
- Centrifuga