Guida completa al congelamento delle cellule: Assicurare vitalità e sterilità
Il congelamento delle cellule è un processo critico nella gestione delle colture cellulari, che garantisce lo stoccaggio e la conservazione a lungo termine di linee cellulari preziose. Sia che si lavori con cellule umane o animali, seguire protocolli precisi e mantenere rigorose tecniche asettiche è fondamentale per ottenere una crioconservazione di successo.
Questa guida fornisce istruzioni dettagliate sui materiali, i reagenti e le procedure passo-passo necessarie per congelare efficacemente le cellule preservandone la vitalità e la sterilità. Seguendo queste linee guida, i ricercatori possono conservare con fiducia e successivamente rianimare le colture cellulari con una perdita minima della vitalità cellulare, mantenendo l'integrità e l'affidabilità dei risultati sperimentali.
Per cominciare, è essenziale stabilire un ambiente di lavoro sterile. Le corrette tecniche asettiche svolgono un ruolo cruciale nel prevenire la contaminazione e garantire la sterilità delle colture.
Tecnica asettica
Seguire le tecniche asettiche durante tutto il processo per garantire la sterilità delle colture.
Processo completo di congelamento delle cellule
Questo diagramma di flusso fornisce una guida visiva dettagliata alle fasi essenziali del corretto congelamento delle cellule. Seguite queste procedure per garantire un'elevata vitalità e integrità delle cellule durante il processo di crioconservazione.
Preparazione del terreno di congelamento
Preparare il terreno di congelamento crioprotettivo in base al tipo di cellula:
- Colture con terreno contenente FBS: 90% FBS + 10% DMSO o 70% terreno di crescita, 20% FBS e 10% DMSO
- Cellule che richiedono glicerolo: 90% FBS + 10% glicerolo
Considerare l'acquisto del nostro terreno di congelamento preformulato:
- Terreno di congelamento CM-1: per protocolli che richiedono un terreno contenente siero bovino fetale (FBS)
- Terreno di congelamento CM-ACF - senza siero: Per un'alternativa priva di FBS
Etichettatura e documentazione
Etichettare le crioviali con i seguenti dati:
- Data
- Nome del ricercatore
- Numero di cellule
- Numero di passaggio
- Tipo di cellula
- Eventuali informazioni aggiuntive (ad esempio, modifiche genetiche)
Preparazione delle cellule
Per le cellule aderenti:
- Monitorare le cellule fino a raggiungere l'85-95% di confluenza
- Aspirare il vecchio terreno di coltura
- Sciacquare il monostrato cellulare con PBS privo di calcio e magnesio
- Staccare le cellule con Accutase, tripsina o tripsina-EDTA e neutralizzare con il terreno di coltura, se necessario
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta Falcon da 50 mL
Per le cellule in sospensione:
- Controllare la densità e lo stato di salute delle cellule al microscopio
- Trasferire la sospensione cellulare direttamente in una provetta Falcon da 50 mL
Conteggio e centrifugazione delle cellule
- Contare le cellule con un emocitometro o un contacellule automatico
- Centrifugare a 300g per 3-5 minuti a temperatura ambiente per pellettizzare le cellule
- Aspirare con cura il surnatante, evitando di disturbare il pellet cellulare
- Riscaldare il terreno di coltura preparato a 37°C prima dell'uso
Crioconservazione
- Risospendere il pellet di cellule nel terreno di congelamento a una densità di 2,0 milioni di cellule/mL per le cellule aderenti e di 5 milioni di cellule/mL per le cellule in sospensione, o alla concentrazione desiderata
- Aliquotate 1,0 mL (o più, se necessario) della sospensione cellulare in crioviali etichettate
- Utilizzare un metodo di congelamento lento prima di trasferire le cellule alla conservazione a lungo termine
| ? Metodo | ? Fasi |
|---|---|
|
❄️ Congelamento manuale |
1️⃣ Mettere le cellule nel terreno di coltura in un congelatore a 4°C per 40 minuti. 2️⃣ Trasferire in un congelatore a -80°C per 24 ore. 3️⃣ Conservare le cellule in azoto liquido per la conservazione a lungo termine |
|
? Utilizzo di Mr. Frosty |
1️⃣ Preparare le cellule in crioviali con il mezzo di congelamento. 2️⃣ Collocare le crioviali nel contenitore Mr. Frosty. 3️⃣ Conservare a -80°C per 24 ore prima di trasferire in azoto liquido |
|
? Congelatore a velocità controllata |
1️⃣ Programmare il dispositivo per diminuire gradualmente la temperatura. 2️⃣ Collocare le cellule preparate nel congelatore. 3️⃣ Dopo il ciclo di congelamento, trasferire le cellule in azoto liquido |
- Conservare le crioviali a temperature inferiori a -130°C o in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
Materiali e reagenti
- crioviali da 1-2 mL
- Unità di congelamento CoolCell® o congelatore a velocità controllata
- Terreno di congelamento crioprotettivo (ad esempio, terreno crioprotettivo fai-da-te, CM-1, CM-ACF, o terreni specializzati)
- Siero fetale bovino (FBS) o terreno condizionato
- DMSO o glicerolo
- PBS privo di calcio e magnesio
- Accutasi, Tripsina o Tripsina-EDTA (per cellule aderenti)
- provette Falcon da 15 mL o 50 mL
- Emocitometro o contatore cellulare automatico
- Centrifuga