Pubblicato: 2023 | Ultima revisione: maggio 2026

Tecniche di dissociazione delle colture cellulari

La dissociazione delle colture cellulari è una fase fondamentale nella gestione delle colture cellulari. Consiste nel distaccare le cellule dalla superficie di crescita per consentire la subcoltura o il raccolto. Questa sezione illustra due metodi principali: l'uso di tamponi di dissociazione privi di enzimi e l'uso di reagenti enzimatici.

Utilizzo di tamponi di dissociazione cellulare privi di enzimi

Questo metodo è delicato e mantiene l'integrità cellulare senza l'uso di enzimi:

1. Preparazione
   • Assicurarsi che tutti i reagenti siano riscaldati a 37 °C prima dell'uso per evitare uno shock alle cellule.
2. Rimozione del terreno di coltura:
   • Eliminare il vecchio terreno di coltura dal recipiente di coltura.
3. Risciacquo
   • Risciacquare i monostrati cellulari con 5 ml di PBS privo di calcio e magnesio per ogni fiasca T75 o piastra da 100 mm.
   • Agitare delicatamente la provetta per 30-60 secondi a temperatura ambiente.
   • Aspirare ed eliminare la soluzione di risciacquo.
   • Ripetere questa fase di risciacquo ancora una volta.
4. Disociazione
   • Aggiungere circa 5 ml di tampone di dissociazione cellulare privo di enzimi al recipiente.
   • Agitare delicatamente a temperatura ambiente per 1-2 minuti e verificare la dissociazione al microscopio.
   • Se necessario, picchiettare il pallone o la piastra contro la mano per staccare le cellule.
   • Se le cellule sono aderenti, lasciarle riposare a temperatura ambiente per altri 2-5 minuti e, se necessario, picchiettare nuovamente, utilizzando altro tampone di dissociazione.
   • Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere almeno 5 ml di terreno di coltura completo per neutralizzare il tampone di dissociazione e risospendere le cellule.
5. Controllo della vitalità
   • Monitorare la vitalità cellulare durante la subcoltura, assicurandosi che rimanga superiore al 90%.

Utilizzo di altri reagenti per la dissociazione

Questo metodo consente l'uso di vari reagenti di dissociazione:

1. Rimozione del terreno di coltura usato
   • Eliminare i vecchi terreni di coltura dal recipiente di coltura.
2. Lavaggio delle cellule
   • Lavare le cellule con una soluzione salina bilanciata priva di calcio e magnesio, oppure utilizzare EDTA.
   • Aggiungere delicatamente la soluzione di lavaggio sul lato opposto alle cellule e agitare la provetta per 1-2 minuti prima di eliminare la soluzione di lavaggio.
3. Dissociazione
   • Applicare da 2 a 3 ml della soluzione di dissociazione scelta per ogni 25 cm² di superficie di coltura, assicurandosi di coprire il foglio cellulare.
   • Incubare il recipiente a 37 °C e agitare delicatamente. La dissociazione avviene in genere entro 5-15 minuti, a seconda della linea cellulare.
   • Per le cellule più ostinate, picchiettare la provetta può accelerare il processo.
   • Osservare attentamente le cellule per evitare una sovraesposizione e potenziali danni.
4. Raccolta delle cellule
   • Una volta che le cellule si sono completamente distaccate, lasciarle raccogliere sul fondo della provetta mettendola in posizione verticale.
   • Aggiungere il terreno di coltura completo, quindi disperdere e raccogliere le cellule pipettando sopra lo strato cellulare.
   • Contare le cellule e procedere con la subcoltura.

In entrambi i metodi, è importante determinare le condizioni ottimali per ciascuna linea cellulare attraverso l'osservazione empirica. Il processo dovrebbe preservare la vitalità cellulare, che dovrebbe essere controllata regolarmente per assicurarsi che superi il 90% durante la subcoltura. Queste procedure forniscono una base che i ricercatori possono adattare in base ai requisiti e alle caratteristiche specifiche delle loro linee cellulari.

Panoramica delle tecniche per la subcoltura delle cellule aderenti

Un efficace subcoltivaggio delle cellule aderenti richiede il loro distacco dal recipiente di coltura. Vengono impiegati vari metodi, ciascuno adatto a diversi tipi di cellule e condizioni. Quando si seleziona un metodo di dissociazione, è fondamentale considerare le esigenze specifiche della linea cellulare e gli obiettivi dell'esperimento. Il monitoraggio regolare della vitalità cellulare, con l'obiettivo di superare il 90% al momento della subcoltura, è essenziale per la salute e la produttività continue della coltura. Ecco una panoramica di queste procedure: