Cellule HEK293T: sfruttare il potenziale negli studi sulla trasfezione

Le cellule HEK293T sono cellule renali embrionali umane ampiamente utilizzate nella biotecnologia industriale, nella tossicologia e nella ricerca sul cancro. Queste cellule immortalizzate vengono utilizzate anche per produrre una varietà di proteine terapeutiche e virus.

Caratteristiche generali e origine delle cellule HEK293T

Questa sezione dell'articolo tratterà l'origine e le informazioni generali sulla linea cellulare HEK293T. 

• La linea cellulare HEK293T ha origine da cellule renali embrionali umane primarie coltivate in laboratorio. I ricercatori hanno sviluppato queste cellule all'inizio degli anni '70 trasfettando cellule renali embrionali con frammenti di DNA dell'adenovirus di tipo 5. I ricercatori hanno creato la linea cellulare HEK293T introducendo il grande antigene T del virus simiano 40 (SV40) nel genoma delle cellule HEK293. Questa modifica ha permesso ai ricercatori di trasfettare facilmente le cellule 293 e le ha rese adatte alla produzione di proteine e agli studi sull'espressione genica [1].
• Le cellule HEK293T possiedono una morfologia di tipo epiteliale. Presentano una forma allungata e appiattita con un confine cellulare ben definito.
• Le dimensioni delle cellule HEK293T variano tra gli 11 e i 15 µm di diametro.
• Le cellule HEK293T con l'antigene T grande del SV40 possiedono un cariotipo complesso. Queste cellule sono ipotriploidi, contengono 3 volte meno cromosomi rispetto a un gamete aploide e possiedono un numero modale di cromosomi pari a 64.

Qual è la differenza tra HEK293T e HEK293?

Sia la linea cellulare HEK293 che quella HEK293T sono di origine umana. L'HEK293T è un derivato popolare della linea cellulare HEK293. Gli scienziati hanno sviluppato queste cellule dalle cellule renali embrionali umane 293 originali trasfettandole con l'antigene T grande SV40, mentre hanno stabilito le cellule HEK293 immortalizzate trasformando e coltivando cellule renali embrionali umane con frammenti di DNA dell'adenovirus umano 5 tagliati.

Tecnologie cellulari e applicazioni biomediche delle cellule HEK293T

Coltura cellulare e banca di cellule nella ricerca sulle cellule HEK293T

Le cellule HEK293T, derivate da cellule renali embrionali umane 293, trovano ampio impiego nella coltura cellulare grazie alla loro crescita robusta e alla facilità di trasfezione. Per lavorare con queste cellule, i ricercatori devono dare priorità alla banca cellulare, che comporta la conservazione delle cellule per un uso esteso a fini di ricerca e terapeutici. Devono utilizzare un approccio graduale alla banca cellulare per preservare le proprietà delle cellule e garantire la loro vitalità a lungo termine. La creazione di banche cellulari richiede il rispetto delle norme di buona pratica di fabbricazione per garantire la vitalità e l'integrità delle cellule per le applicazioni terapeutiche.

Le buone pratiche di fabbricazione sono fondamentali nella produzione di banche cellulari HEK293T, che sono fondamentali sia per la ricerca che per le applicazioni terapeutiche. La banca cellulare principale funge da punto di riferimento per tutti i prodotti cellulari successivi. La produzione di queste cellule per applicazioni terapeutiche, come la produzione di lentivirus per le terapie geniche, segue rigorosi standard normativi per garantire la sicurezza e l'efficacia dei prodotti finali.

Protocolli e test che utilizzano HEK293T

Nella citotecnologia, vengono progettati protocolli e test specifici per valutare le proprietà delle cellule HEK293T. Questi includono la valutazione dell'efficacia dei vettori di terapia genica e l'interazione della cellula con la matrice extracellulare in una coltura in piastra o in sospensione. Per mantenere l'integrità delle cellule HEK293T, i ricercatori scelgono con precisione i reagenti per la trasfezione e sottopongono le materie prime a rigorosi test di controllo qualità.

Applicazioni di ricerca della linea cellulare HEK293T

• Sviluppo di vaccini: la linea cellulare HEK293T è stata utilizzata per studiare i virus e produrre vaccini a vettore virale per combattere una varietà di infezioni virali. Uno studio ha utilizzato questa linea cellulare renale embrionale per indagare le basi strutturali e funzionali dell'ingresso del virus COVID-19 nelle cellule attraverso l'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2) umano [3]. Inoltre, uno studio recente ha utilizzato cellule HEK93T per generare particelle di lentivirus pseudotipizzate con la proteina spike del SARS-CoV-2 [4].
  
• Ricerca tossicologica: questa linea cellulare renale embrionale umana è ampiamente utilizzata per testare la tossicità e l'efficacia dei farmaci. Una ricerca condotta nel 2022 ha utilizzato HEK293T come linea cellulare umana normale per convalidare il potenziale citotossico degli estratti di Caladium lindenii contro la linea cellulare di cancro al fegato HepG2 [5].
• Studi sull'espressione genica: la linea cellulare HEK293T con l'antigene T grande SV40 è altamente suscettibile alla trasfezione, quindi adatta per studi sull'espressione genica. Uno studio ha utilizzato le cellule HEK293T per studiare il ruolo dell'RNA non codificante lungo SNHG16 nella regolazione delle funzioni dei trofoblasti. Lo studio ha rivelato che l'LncRNA SNHG16 interagisce con l'asse miR-218-5p/LASP1 per mediare questi effetti [6].

Innovazioni nella terapia cellulare che utilizzano cellule HEK293T

Progressi nella terapia cellulare con HEK293T

Le cellule HEK293T contribuiscono in modo significativo al panorama della terapia cellulare, in particolare nella generazione di vettori virali per la terapia genica. Queste cellule sono essenziali nei processi di produzione che aderiscono alle normative di buona pratica di fabbricazione, poiché garantiscono la produzione di prodotti di terapia genica di alta qualità. La formazione del personale di produzione si concentra anche sulla gestione delle proprietà uniche delle cellule HEK293T e sul mantenimento di uno standard elevato per i prodotti medicinali derivati da queste cellule.

Le cellule HEK293T nelle sperimentazioni cliniche e nella terapia genica

La linea cellulare HEK293T svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo di prodotti per la terapia genica ed è parte integrante delle sperimentazioni cliniche volte a introdurre sul mercato nuove terapie cellulari. Ciò comporta lo sfruttamento dell'elevata trasfettività della linea cellulare per il trasferimento genico, utilizzando vettori quali i vettori di impacchettamento lentivirali, dove la mutazione D64V dell'integrasi ha rappresentato un notevole progresso per aumentare la sicurezza.

Tecniche innovative nella coltura cellulare HEK293T

La versatilità delle cellule HEK293T supporta tecniche innovative sia nelle colture cellulari bidimensionali che in quelle di dimensioni più complesse. Questa adattabilità è fondamentale nell'esplorazione di prodotti cellulari per vari tipi di ricerca biomedica, compresa la ricerca sul cancro, dove queste cellule vengono utilizzate per studiare i processi tumorigenici e per i test sui farmaci. Inoltre, la linea HEK293T è fondamentale nella produzione di particelle lentivirali, che sono cruciali sia per la ricerca che per i processi di produzione di vettori terapeutici.

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Informazioni sulla coltura della linea cellulare HEK293T

Le cellule HEK293T sono ampiamente coltivate nei laboratori di ricerca. Prima di avviare la coltura cellulare HEK293T, è necessario sapere: qual è il tempo di raddoppio delle cellule HEK293T? Qual è il terreno di coltura HEK293T? Qual è la densità di semina delle cellule HEK293T?

Punti chiave per la coltura delle cellule HEK293T

Tempo di raddoppio:

Il tempo di raddoppio riportato per le cellule HEK293T è di 30 ore.

Aderenzi o in sospensione:

HEK293T è una linea cellulare aderente.

Densità di semina:

Le cellule HEK293T vengono seminate a una densità di 1 x 10⁴ cellule/cm². A questa densità di semina, le cellule possono formare un monostrato confluente in circa 4 giorni. Per la semina, le cellule aderenti vengono staccate utilizzando la soluzione di dissociazione Accutase. Le cellule staccate vengono centrifugate e poi risospese con cura utilizzando un terreno di coltura. Successivamente, le cellule vengono trasferite in nuove fiasche per la coltura.

Terreno di coltura:

Le cellule HEK293T vengono coltivate in EMEM (Eagle's minimal essential medium) contenente 1,0 g/L di L-glucosio, 2,2 g/L di NaHCO3, 2,0 mM di L-glutammina e 10% di siero fetale bovino. Il terreno deve essere sostituito due volte alla settimana.

Condizioni di crescita:

Le colture di cellule HEK293T vengono mantenute in un incubatore umidificato a 37 °C con un'alimentazione di CO2 al 5%.

Conservazione:

Le cellule renali embrionali umane HEK293T vengono conservate in fase vapore di azoto liquido o a una temperatura inferiore a -150 °C per periodi più lunghi.

Processo di congelamento e terreno di coltura:

Le cellule HEK293 possono essere congelate in terreni di congelamento CM-1 o CM-ACF. Per le cellule HEK293T si raccomandano processi di congelamento lento che consentano un abbassamento graduale della temperatura di 1 °C, al fine di preservarne la vitalità.

Processo di scongelamento:

Una fiala di cellule congelate viene agitata rapidamente in un bagno d'acqua (37 °C) fino a quando non rimane un piccolo grumo di ghiaccio. Le cellule vengono risospese nel mezzo e centrifugate per eliminare i componenti del mezzo di congelamento. Le cellule recuperate vengono quindi coltivate in nuove fiasche contenenti mezzo di crescita. 

Livello di biosicurezza:

Per la manipolazione e la conservazione delle colture cellulari HEK293T è necessario un laboratorio di livello di biosicurezza 1.

Domande frequenti sulla coltura e sulle applicazioni delle cellule HEK293T

Cellule HEK293T: Pubblicazioni di ricerca

In questa sezione abbiamo citato alcune pubblicazioni di ricerca promettenti che trattano delle cellule HEK293T.

Sviluppo di vaccini a mRNA contro il SARS-CoV-2 che codificano per il dominio N-terminale della proteina Spike e il dominio di legame al recettore

Questa pubblicazione sarà pubblicata su BioRxiv nel 2022. Questo studio ha utilizzato cellule HEK293T per sviluppare vaccini a mRNA contro il virus COVID-19 che codificano per i domini N-terminale e RBD (dominio di legame al recettore) del gene spike.

Il carcinoma mammario triplo negativo positivo all'RNA circolare HER2 è sensibile al Pertuzumab

Questa ricerca è stata pubblicata su Molecular Cancer nel 2020. Lo studio ha ipotizzato che l'espressione dell'RNA circolare HER2 nelle cellule del carcinoma mammario triplo negativo lo renda sensibile al trattamento farmacologico con Pertuzumab. In questo studio, i ricercatori hanno utilizzato cellule HEK293 per la produzione di lentivirus e la trasfezione del gene circolare HER2.

Ruolo antivirale dell'IFITM3 nell'infezione da virus schiumoso prototipo

Questo articolo è stato pubblicato su Virology Journal nel 2022. Questo studio ha utilizzato cellule HEK293T per indagare l'effetto antivirale di IFITM3 (proteina transmembrana 3 indotta dall'interferone) in un'infezione da virus schiumoso prototipo (PFV).

Il miRNA-21 media l'attività antiangiogenica della metformina agendo sull'espressione di PTEN e SMAD7 e sulla via PI3K/AKT

Questo articolo di ricerca pubblicato su Nature Scientific Reports (2017) ha utilizzato cellule HEK293T e ha studiato come il miRNA-21 media gli effetti antiangiogenici indotti dalla metformina regolando la via di segnalazione PI3K/AKT e l'espressione genica di SMAD7 e PTEN.

Il microRNA-608 inibisce la proliferazione del cancro alla vescica attraverso la via di segnalazione AKT/FOXO3a

Questa ricerca è stata pubblicata sulla rivista Molecular Cancer nel 2017. Lo studio ha utilizzato cellule HEK293 per indagare il potenziale antiproliferativo del miRNA-608 contro il cancro alla vescica.

Risorse per la linea cellulare HEK293T: protocolli, video e altro

Di seguito sono riportate alcune risorse sulle cellule HEK293T:

• Trasfezione delle cellule HEK293T.
• Trasfezione delle cellule HEK: questo video mostra il protocollo generale di trasfezione per la linea cellulare renale embrionale umana HEK293.
• Passaggio delle cellule: questo video spiega la procedura per la divisione o la subcoltura delle cellule aderenti.

Protocolli di coltura cellulare

I protocolli di coltura cellulare per le cellule HEK293T sono elencati qui.

• Divisione delle cellule HEK293T: questo sito fornisce una guida dettagliata passo dopo passo per la subcoltura delle cellule HEK293.
• Coltura di cellule renali embrionali umane: questo link fornisce il protocollo di coltura delle cellule HEK293T.

Riferimenti

1. Tan, E., et al., La linea cellulare HEK293 come piattaforma per la produzione di proteine ricombinanti e vettori virali. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2021, 9.
2. Kim, M.J., et al., L'AMPKα1 regola la progressione del cancro al polmone e al seno regolando l'asse di segnalazione TRAF6-BECN1 mediato dal TLR4. Cancers (Basel), 2020, 12(11).
3. Wang, Q., et al., Basi strutturali e funzionali dell'ingresso del SARS-CoV-2 tramite l'ACE2 umano. Cell, 2020. 181(4): pagg. 894–904.
4. Gale, E.C., et al., Il rilascio lento a base di idrogel di un vaccino a subunità del dominio di legame al recettore induce risposte anticorpali neutralizzanti contro il SARS-CoV-2. bioRxiv, 2021.
5. Kalsoom, A., et al., Valutazione in vitro del potenziale citotossico degli estratti di Caladium lindenii sulle linee cellulari di epatocarcinoma umano HepG2 e HEK293T normali. Biomed Res Int, 2022, p. 1279961.
6. Yu, Z., et al., LncRNA SNHG16 regola le funzioni dei trofoblasti attraverso l'asse miR-218-5p/LASP1. J Mol Histol, 2021. 52(5): p. 1021-1033.