Cellule HEK293T: Liberare il potenziale negli studi di trasfezione
Lecellule HEK293T sono cellule renali embrionali umane ampiamente utilizzate nella biotecnologia industriale, nella tossicologia e nella ricerca sul cancro. Queste cellule immortalizzate sono anche utilizzate per produrre una varietà di proteine terapeutiche e virus.
Caratteristiche generali e origine delle cellule HEK293T
Questa sezione dell'articolo tratterà l'origine e le informazioni generali sulla linea cellulare HEK293T.
- La linea cellulare HEK293T ha avuto origine da cellule primarie di rene embrionale umano coltivate in laboratorio. I ricercatori hanno sviluppato queste cellule all'inizio degli anni '70 trasfettando cellule di rene embrionale con frammenti di DNA di adenovirus di tipo 5 tagliati. I ricercatori hanno creato la linea cellulare HEK293T introducendo nel genoma delle cellule HEK293 l'antigene T grande del virus simiano 40 (SV40). Questa modifica ha permesso ai ricercatori di trasfettare facilmente le cellule 293 e le ha rese adatte alla produzione di proteine e agli studi di espressione genica [1].
- Le cellule HEK293T possiedono una morfologia simile a quella epiteliale. Hanno una forma allungata e appiattita con un confine cellulare definito.
- Le dimensioni delle cellule HEK293T variano tra 11 e 15 µm di diametro.
- Le cellule HEK293T con antigene SV40 large-t possiedono un cariotipo complesso. Queste cellule sono ipotriploidi, contengono un numero di cromosomi 3 volte inferiore a quello di un gamete aploide e possiedono un numero modale di 64 cromosomi.
Qual è la differenza tra HEK293T e HEK293?
Entrambe le linee cellulari HEK293 e HEK293T sono di origine umana. La HEK293T è un derivato popolare della linea cellulare HEK293. Gli scienziati hanno sviluppato queste cellule a partire dalle cellule originali di rene embrionale umano 293 trasfettandole con l'antigene SV40 large T, mentre hanno creato le cellule HEK293 immortalizzate trasformando e coltivando cellule di rene embrionale umano con frammenti di DNA di adenovirus umano 5 tagliato.
Tecnologie cellulari e applicazioni biomediche delle cellule HEK293T
Coltura e conservazione delle cellule nella ricerca sulle HEK293T
Le cellule HEK293T, derivate dalle cellule 293 del rene embrionale umano, sono ampiamente utilizzate nelle colture cellulari grazie alla loro crescita robusta e alla facilità di trasfezione. Per lavorare con queste cellule, i ricercatori devono dare priorità al cell banking, che prevede la conservazione delle cellule per un uso prolungato nella ricerca e nella terapia. Per preservare le proprietà delle cellule e garantirne la vitalità a lungo termine, i ricercatori devono utilizzare un approccio graduale alla banca delle cellule, che richiede il rispetto delle norme di buona fabbricazione per garantire la vitalità e l'integrità delle cellule per le applicazioni terapeutiche.
Le buone pratiche di fabbricazione sono fondamentali per la produzione di banche di cellule HEK293T, che sono fondamentali sia per la ricerca che per le applicazioni terapeutiche. La banca di cellule master serve come punto di riferimento per tutti i prodotti cellulari successivi. La produzione di queste cellule per applicazioni terapeutiche, come la produzione di lentivirali per terapie geniche, segue standard normativi rigorosi per garantire la sicurezza e l'efficacia dei prodotti finali.
Protocolli e saggi che utilizzano HEK293T
In citotecnologia, protocolli e saggi specifici sono progettati per valutare le proprietà delle cellule HEK293T. Questi includono la valutazione dell'efficacia dei vettori di terapia genica e l'interazione della cellula con la matrice extracellulare in un piatto o in una coltura in sospensione. Per mantenere l'integrità delle cellule HEK293T, i ricercatori scelgono con precisione i reagenti per la trasfezione e sottopongono le materie prime a rigorosi test di controllo della qualità.
Applicazioni di ricerca della linea cellulare HEK293T
- Sviluppo di vaccini: La linea cellulareHEK293T è stata utilizzata per studiare i virus e produrre vaccini basati su vettori virali per combattere diverse infezioni virali. Uno studio ha utilizzato questa linea cellulare di rene embrionale per indagare le basi strutturali e funzionali dell'ingresso nelle cellule del virus COVID-19 attraverso l'enzima di conversione dell'angiotensina umano 2 (ACE2) [3]. Inoltre, uno studio recente ha utilizzato cellule HEK93T per generare particelle di lentivirus SARS-CoV-2 spike-pseudotipate [4].
- Ricerca tossicologica: Questa linea cellulare di rene embrionale umano è ampiamente utilizzata per testare la tossicità e l'efficacia dei farmaci. Una ricerca condotta nel 2022 ha utilizzato la HEK293T come linea cellulare umana normale per convalidare il potenziale citotossico degli estratti di Caladium lindenii contro la linea cellulare di cancro al fegato HepG2 [5].
- Studi di espressione genica: La linea cellulare HEK293T con antigene SV40 large T è altamente adatta alla trasfezione e quindi agli studi di espressione genica. Uno studio ha utilizzato cellule HEK293T per studiare il ruolo del long noncoding RNA SNHG16 nella regolazione delle funzioni del trofoblasto. Lo studio ha rivelato che l'LncRNA SNHG16 interagisce con l'asse miR-218-5p/LASP1 per mediare questi effetti [6].
Innovazioni nella terapia cellulare con cellule HEK293T
Progressi nella terapia cellulare con le cellule HEK293T
Le cellule HEK293T contribuiscono in modo significativo al panorama della terapia cellulare, soprattutto nella generazione di vettori virali per la terapia genica. Queste cellule sono essenziali nei processi di produzione che aderiscono alle norme di buona fabbricazione, in quanto garantiscono la produzione di prodotti di terapia genica di alta qualità. La formazione del personale di produzione si concentra anche sulla gestione delle proprietà uniche delle cellule HEK293T e sul mantenimento di uno standard elevato per i prodotti medicinali derivati da queste cellule.
Cellule HEK293T negli studi clinici e nella terapia genica
La linea cellulare HEK293T svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo di prodotti per la terapia genica ed è parte integrante delle sperimentazioni cliniche volte a portare sul mercato nuove terapie cellulari. Ciò comporta lo sfruttamento dell'elevata trasfettività della linea cellulare per la somministrazione di geni, utilizzando vettori come i vettori lentivirali, dove la mutazione dell'integrasi D64V ha rappresentato un notevole progresso per aumentare la sicurezza.
Tecniche innovative nella coltura delle cellule HEK293T
La versatilità delle cellule HEK293T supporta tecniche innovative sia nelle colture cellulari bidimensionali che in quelle più complesse. Questa adattabilità è fondamentale per l'esplorazione di prodotti cellulari per vari tipi di ricerca biomedica, tra cui la ricerca sul cancro, dove queste cellule sono utilizzate per studiare i processi tumorigenici e i test sui farmaci. Inoltre, la linea HEK293T è fondamentale per la produzione di particelle lentivirali, essenziali sia per la ricerca che per i processi di produzione di vettori terapeutici.
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Informazioni sulla coltura della linea cellulare HEK293T
Le cellule HEK293T sono ampiamente coltivate nei laboratori di ricerca. Prima di sviluppare la coltura di cellule HEK293T, è necessario conoscere: Qual è il tempo di raddoppiamento delle cellule HEK293T? Qual è il terreno di coltura delle HEK293T? Qual è la densità di semina delle HEK293T?
Punti chiave per la coltura delle cellule HEK293T
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Tempo di raddoppiamento: |
Il tempo di raddoppiamento riportato per le cellule HEK293T è di 30 ore. |
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Aderenti o in sospensione: |
HEK293T è una linea cellulare aderente. |
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Densità di semina: |
Le cellule HEK293T sono seminate a una densità di 1 x104 cellule/cm2. A questa densità di semina, le cellule possono formare un monostrato confluente in circa 4 giorni. Per la semina, le cellule aderenti vengono staccate utilizzando la soluzione di dissociazione accutasi. Le cellule staccate vengono centrifugate e poi risospese con cura utilizzando un terreno di crescita. Successivamente, le cellule vengono distribuite in nuove fiasche per la coltura. |
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Terreno di coltura: |
Le cellule HEK293T sono coltivate in EMEM (terreno minimo essenziale di Eagle) contenente 1,0 g/L di L-glucosio, 2,2 g/L di NaHCO3, 2,0 mM di L-glutamina e 10% di siero fetale bovino. Il terreno deve essere sostituito due volte alla settimana. |
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Condizioni di crescita: |
Le colture di cellule HEK293T sono mantenute in un incubatore umidificato a 37°C con un apporto di CO2 del 5%. |
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Conservazione: |
Le cellule di rene embrionale umano HEK293T vengono conservate più a lungo nella fase di vapore dell'azoto liquido o a una temperatura inferiore a -150°C. |
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Processo e terreno di congelamento: |
Le cellule HEK293 possono essere congelate nei mezzi di congelamento CM-1 o CM-ACF. Per le cellule HEK293T si raccomanda un processo di congelamento lento che consenta un calo graduale della temperatura di 1°C per proteggere la loro vitalità. |
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Processo di scongelamento: |
Una fiala di cellule congelate viene agitata rapidamente in un bagno d'acqua (37°C) finché non rimane un piccolo grumo di ghiaccio. Le cellule vengono risospese nel terreno di coltura e centrifugate per eliminare i componenti del terreno di coltura. Le cellule recuperate vengono quindi coltivate in nuove fiasche contenenti terreno di coltura. |
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Livello di biosicurezza: |
Per la manipolazione e la manutenzione delle colture di cellule HEK293T è necessario un laboratorio di livello di biosicurezza 1. |
Linea cellulare HEK293T: Vantaggi e limiti
Le cellule del rene embrionale umano 293T presentano una combinazione unica di vantaggi e limiti. In questa sede esamineremo alcuni dei principali vantaggi e svantaggi di questa linea cellulare.
Pro e contro delle cellule HEK293T
I vantaggi significativi delle cellule HEK293T includono la loro elevata trasfettività: la linea cellulare mostra una notevole efficienza nell'assumere DNA estraneo e nel produrre proteine abbondanti. Questa qualità le rende ampiamente favorite per gli studi di trasfezione transitoria e stabile. Inoltre, le colture di cellule HEK293T sono note per la loro facilità di manutenzione, che le rende una scelta eccellente per vari esperimenti di laboratorio grazie alla loro robustezza e alla semplicità di manipolazione.
Tuttavia, esistono limitazioni associate alle colture di cellule HEK293T. Una delle preoccupazioni principali è il rischio di contaminazione microbica, che può avere un impatto significativo sulla morfologia cellulare, sull'espressione genica e su altre caratteristiche critiche, portando potenzialmente a risultati sperimentali imprecisi. Inoltre, sebbene le cellule HEK293T siano adatte per esperimenti a lungo termine, periodi di coltura prolungati possono compromettere la salute delle cellule. Ciò può influire sull'efficienza di trasfezione e sui tassi di crescita, motivo per cui si raccomanda di limitare il numero di passaggi a 20 o meno per mantenere l'integrità delle cellule.
Domande frequenti sulla coltura e sulle applicazioni delle cellule HEK293T
Cellule HEK293T: Pubblicazioni di ricerca
In questa sezione abbiamo citato alcune promettenti pubblicazioni di ricerca che riguardano le cellule HEK293T.
Questa pubblicazione sarà pubblicata su BioRxiv nel 2022. Questo studio ha utilizzato cellule HEK293T per sviluppare vaccini a base di mRNA del virus COVID-19 che codificano i domini N-terminale del gene spike e RBD (receptor binding domain).
Il carcinoma mammario circolare HER2 RNA positivo triplo negativo è sensibile a Pertuzumab
Questa ricerca è stata pubblicata su Molecular Cancer nel 2020. Lo studio propone che l'espressione dell'RNA circolare di HER2 nelle cellule di cancro al seno triplo negativo le renda sensibili al trattamento farmacologico con Pertuzumab. I ricercatori hanno utilizzato cellule HEK293 per la produzione di lentivirus e la trasfezione del gene circolare HER2 in questo studio.
Ruolo antivirale di IFITM3 nell'infezione da prototipo di virus schiumoso
Questo lavoro è stato pubblicato sulla rivista Virology Journal nel 2022. Questo studio ha utilizzato cellule HEK293T per analizzare l'effetto antivirale di IFITM3 (proteina transmembrana 3 indotta dall'interferone) in un prototipo di virus schiumoso (PFV).
Questa ricerca pubblicata su Nature Scientific Reports (2017) ha utilizzato cellule HEK293T e ha studiato che il miRNA-21 media gli effetti antiangiogenici indotti dalla metformina regolando la via di segnalazione PI3K/AKT e l'espressione dei geni SMAD7 e PTEN.
Questa ricerca è stata pubblicata sulla rivista Molecular Cancer nel 2017. Questo studio ha utilizzato cellule HEK293 per indagare il potenziale antiproliferativo del miRNA-608 contro il cancro della vescica.
Risorse per la linea cellulare HEK293T: Protocolli, video e altro
Di seguito sono riportate alcune risorse sulle cellule HEK293T:
- Trasfezione di cellule HEK293T.
- Trasfezione di cellule HEK: Questo video mostra il protocollo generale di trasfezione per la linea cellulare di rene embrionale umano HEK293.
- Passaggio di cellule: Questo video spiega la procedura per dividere o subcollocare le cellule aderenti.
Protocolli di coltura cellulare
I protocolli di coltura cellulare per le cellule HEK293T sono elencati qui.
- Divisione delle cellule HEK293T: Questo sito fornisce una guida dettagliata passo-passo per la subcoltura delle cellule HEK293.
- Coltura di cellule di rene embrionale umano: Questo link fornisce il protocollo di coltura delle cellule HEK293T.
Riferimenti
- Tan, E., et al., HEK293 Cell Line as a Platform to Produce Recombinant Proteins and Viral Vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2021, 9.
- Kim, M.J., et al., AMPKα1 regola la progressione del cancro al polmone e al seno regolando l'asse di segnalazione TRAF6-BECN1 mediato da TLR4. Cancers (Basilea), 2020, 12(11).
- Wang, Q., et al., Basi strutturali e funzionali dell'ingresso del SARS-CoV-2 utilizzando l'ACE2 umano. Cell, 2020. 181(4): p. 894-904.
- Gale, E.C., et al., Il rilascio lento di un vaccino a subunità con dominio legante il recettore, basato su idrogel, suscita risposte anticorpali neutralizzanti contro il SARS-CoV-2. bioRxiv, 2021.
- Kalsoom, A., et al., Valutazione in vitro del potenziale citotossico degli estratti di Caladium lindenii su linee cellulari umane di epatocarcinoma HepG2 e normali HEK293T. Biomed Res Int, 2022, pag. 1279961.
- Yu, Z., et al., LncRNA SNHG16 regola le funzioni del trofoblasto attraverso l'asse miR-218-5p/LASP1. J Mol Histol, 2021. 52(5): p. 1021-1033.