Tecniche di dissociazione delle colture cellulari

La dissociazione delle colture cellulari è una fase critica del mantenimento delle colture cellulari. Comporta il distacco delle cellule dalla loro superficie di crescita per consentire la subcoltura o la raccolta. Questa sezione illustra due metodi principali: l'uso di tamponi di dissociazione privi di enzimi e l'uso di reagenti enzimatici.

1.uso di tamponi per la dissociazione cellulare senza enzimi

Questo metodo è delicato e mantiene l'integrità cellulare senza l'uso di enzimi:

1. Preparazione
   • Assicurarsi che tutti i reagenti siano riscaldati a 37°C prima dell'uso per evitare shock alle cellule.
2. Rimozione del terreno di coltura
   • Eliminare il vecchio terreno di coltura dal recipiente di coltura.
3. Risciacquo
   • Sciacquare i monostrati cellulari con 5 ml di PBS privo di calcio e magnesio per fiasca T75 o piatto da 100 mm.
   • Agitare delicatamente il recipiente per 30-60 secondi a temperatura ambiente.
   • Aspirare e gettare la soluzione di risciacquo.
   • Ripetere questa fase di risciacquo un'altra volta.
4. Dissociazione
   • Aggiungere circa 5 ml di tampone di dissociazione cellulare senza enzimi al recipiente.
   • Far oscillare delicatamente a temperatura ambiente per 1-2 minuti e controllare la dissociazione al microscopio.
   • Se necessario, battere la fiasca o il piatto contro la mano per staccare le cellule.
   • Se le cellule sono aderenti, lasciarle riposare a temperatura ambiente per altri 2-5 minuti e, se necessario, picchiettare di nuovo, utilizzando altro tampone di dissociazione.
   • Una volta staccate le cellule, aggiungere almeno 5 ml di terreno di coltura completo per neutralizzare il tampone di dissociazione e risospendere le cellule.
5. Controllo della vitalità
   • Monitorare la vitalità cellulare durante la subcoltura, assicurandosi che rimanga superiore al 90%.

2.utilizzo di altri reagenti per la dissociazione

Questo metodo consente l'uso di vari reagenti per la dissociazione:

1. Rimozione del terreno usato
   • Eliminare il terreno vecchio dal recipiente di coltura.
2. Lavaggio delle cellule
   • Lavare le cellule con una soluzione salina bilanciata priva di calcio e magnesio, oppure utilizzare EDTA.
   • Aggiungere delicatamente la soluzione di lavaggio al lato opposto alle cellule e far oscillare il recipiente per 1-2 minuti prima di scartare il lavaggio.
3. Dissociazione
   • Applicare da 2 a 3 ml della soluzione di dissociazione scelta per 25 cm² di superficie di crescita, assicurando la copertura del foglio cellulare.
   • Incubare il recipiente a 37°C e agitare delicatamente. La dissociazione avviene in genere entro 5-15 minuti, a seconda della linea cellulare.
   • Per le cellule ostinate, picchiettare il recipiente può accelerare il processo.
   • Osservare attentamente le cellule per evitare una sovraesposizione e potenziali danni.
4. Raccolta delle cellule
   • Una volta che le cellule sono completamente staccate, lasciarle raccogliere sul fondo del recipiente mettendolo in posizione verticale.
   • Aggiungere il terreno completo, quindi disperdere e raccogliere le cellule pipettando sullo strato cellulare.
   • Contare e procedere alla subcoltura.

In entrambi i metodi, è importante determinare le condizioni ottimali per ciascuna linea cellulare attraverso l'osservazione empirica. Il processo deve preservare la vitalità cellulare, che deve essere controllata di routine per superare il 90% durante la subcoltura. Queste procedure forniscono una base che i ricercatori possono adattare in base ai requisiti e alle caratteristiche specifiche delle loro linee cellulari.

3.panoramica delle tecniche di subcoltura delle cellule aderenti

Una subcoltura efficace delle cellule aderenti richiede il loro distacco dal recipiente di coltura. Vengono impiegati vari metodi, ciascuno adatto a diversi tipi di cellule e condizioni. Quando si sceglie un metodo di dissociazione, è fondamentale considerare le esigenze specifiche della linea cellulare e gli obiettivi dell'esperimento. Il monitoraggio regolare della vitalità cellulare, con l'obiettivo di superare il 90% al momento della subcoltura, è essenziale per la salute e la produttività della coltura. Ecco una panoramica di queste procedure: