HaCaT sejtek - A bőr biológiájának és betegségeinek feltárása
AHaCaT sejtek emberi epidermális keratinocitákból származnak, és gyakran használják őket az epidermális homeosztázis és a kapcsolódó kórképek vizsgálatára. Ezeket a sejteket spontán immortalizált humán keratinocitáknak tekintik, ami azért figyelemre méltó, mert normális bőrkeratinocitákból származnak, anélkül, hogy válsággal vagy növekedési retardációval találkoztak volna. Ez az egyedülálló eredet a HaCaT sejteknek olyan genetikai és növekedési tulajdonságokat kölcsönöz, amelyek eltérnek más sejtvonalaktól. Annak ellenére, hogy a HaCaT sejtvonal in vitro transzformált fenotípust mutat, agaron vagy műanyagon klonogén tulajdonságokkal, nem tumorogén. Mivel a HaCaT sejtek az első olyan felnőtt emberi bőrből származó stabil epitélsejtvonal, amely normális differenciálódást mutat, értékes eszközt jelentenek a keratinizáció szabályozásának vizsgálatához az emberi sejtekben. Ezek a sejtek széleskörűen alkalmazhatók, mivel képesek in vitro hatékonyan proliferálni és differenciálódni.
- A HaCaT sejtek jellemzői
- A HaCaT sejtek genetikai jellemzői és eredete
- A HaCaT sejtek kinyerése 5 egyszerű lépésben
- A HaCaT sejtek alkalmazásai
- Kiemelt videók: A HaCaT sejtek világának felfedezése
1.a HaCaT sejtek jellemzői
A HaCaT sejtek alacsony kalciumtartalmú körülmények között tenyészthetők, és orsó alakúak, amelyekből hiányoznak a sejtek közötti szoros kötések, mint az ugyanilyen körülmények között tartott primer sejtek esetében. A normál epidermiszben a keratinociták a bazális rétegben lévő őssejtekből fejlődnek ki, és a szálkás és szemcsés rétegeken keresztül haladnak, mielőtt elérnék a szaruréteget és a környezetbe deszkamálódnának. A proliferáció és a deszkamáció közötti szigorúan szabályozott egyensúly 28 naponként teljes megújulást vagy változást eredményez, egy komplex folyamatot, amelyet keratinizációnak nevezünk. Ez a folyamat erősen szabályozott, és a génexpresszió, a szerkezeti felépítés és az enzimaktivitás markáns változásaival jár. Az in vitro és in vivo elemzésekhez a HaCaT sejteknek meg kell őrizniük a humán epidermisz sejtek differenciált rétegeire jellemző epidermális keratinokat, amelyek elengedhetetlenek a bőr szerkezeti integritásának és rugalmasságának fenntartásához. Bár a HaCaT sejtekben előfordulhatnak szekvenciális kromoszómaelváltozások, ezek nem feltétlenül kapcsolódnak jelentős differenciálódási problémákhoz, hanem a humán felnőtt keratinociták spontán átalakulását mutatják in vitro.
2.a HaCaT sejtek genetikai jellemzői és eredete
A HaCaT sejtek egy spontán immortalizált humán keratinocita sejtvonal, amely felnőtt bőrből származik, és egyedülálló evolúciós utat képvisel. Ezek a sejtek mutációkkal rendelkeznek a p53 gén mindkét alléljában, ami jellemző az UV-sugárzás által indukált mutációkra [3,4]. Emellett a HaCaT sejtek feltételezhetően a p53 tumorszupresszor gén mutációi, majd az öregedési gének elvesztése révén jöttek létre [5].
A p53 tumorszuppresszor gén, amely a DNS-javításban betöltött szerepéről és a genom őrzőjeként ismert, indukálja az emberi bőr DNS-károsodásra adott válaszát [4]. Megfigyelték, hogy a HaCaT sejtek a p53 gén in vivo mutációja miatt részben elvesztették a DNS-károsodással szembeni védekező mechanizmusukat, így hajlamosak az emelkedett tenyésztési hőmérsékletre adott válaszként felhalmozódó citogenetikai változásokra. A HaCaT sejtek immortalizálásának másik mechanizmusa a telomeráz enzim fokozott aktivitásával jár együtt [7]. Normális sejtekben a telomerek minden sejtosztódással folyamatosan rövidülnek, amíg a sejtek el nem érik a sejtek szeneszcenciáját. A telomeráz egy speciális sejtes enzimkomplex, amely reverz transzkriptáz aktivitással rendelkezik, és amely fenntartja a telomerek stabil hosszát. Ezzel szemben a HaCaT sejtek jelentősen megnövekedett telomeráz aktivitást mutatnak, ami jól karbantartott telomerhosszúságot eredményez. Ezek a megfigyelések megerősítik a telomeráz szerepét a HaCaT sejtek immortalizációs folyamatában.
Három specifikus kromoszómatranszlokációt azonosítottak, amelyek a 3p, 4p és 9p kromoszómakarok egy-egy példányának elvesztését, a 9q nyereségét és izokromoszóma kialakulását eredményezik. A 3p kromoszóma rövid karjának elvesztése az öregedési gének elvesztéséhez és a HaCaT sejtek immortalizációjához vezethet [8]. A HaCaT sejtek hipodiploidok, és különálló és stabil marker kromoszómákkal rendelkeznek, amelyek monoklonális eredetüket képviselik. A HaCaT-sejtvonal jellemzőit és fejét hipervariábilis miniszatellita markerekkel végzett DNS-ujjlenyomat-vizsgálattal igazolták [3-6].
3.a HaCaT sejtek betakarításának módja 5 egyszerű lépésben
- Távolítsa el a táptalajt, és öblítse le a megtapadt sejteket 3-5 ml kalcium és magnézium nélküli PBS-sel T25 lombikok esetében vagy 5-10 ml-rel T75 lombikok esetében.
- Adjon hozzá 1-2 mL frissen készített 0,05%-os EDTA-oldatot T25 lombikonként vagy 2,5 mL-t T75 lombikonként, biztosítva, hogy a teljes sejtlapot lefedje, és inkubálja 37°C-on 10 percig.
- Adjunk hozzá T25 lombikonként 1 ml frissen készített tripszin/EDTA (0,05%/0,025%) oldatot, vagy T75 lombikonként 2,5 ml-t, ismét biztosítva a sejtlap teljes lefedettségét. A sejteknek 1-2 percen belül le kell válniuk.
- Állítsuk le a tripszin aktivitást FBS-tartalmú sejttenyésztő közeg hozzáadásával.
- A sejteket adagoljuk új, friss sejttenyésztő közeget tartalmazó lombikokba.
4. A HaCaT sejtek alkalmazása
A HaCaT sejtek értékes eszközt jelentenek a keratinociták tanulmányozására [9]. Ezek a halhatatlan sejtek preneoplasztikus sejtekként működnek, és betekintést nyújthatnak a malignus és neoplasztikus transzformációban szerepet játszó változásokba [10]. A monoréteges HaCaT sejtkultúrák elengedhetetlenek a sejttoxicitást és az in vitro sebgyógyulást vizsgáló alkalmazásokhoz. A HaCaT-sejtek felhasználhatók a különböző hatóanyagok és neoplasztikus vagy gyulladásos folyamatok által okozott bőrtoxicitás értékelésére is. Felhasználhatók a bőr allergiás reakcióinak különböző mechanizmusainak, a reaktív oxigénfajok és az UV-sugárzás hatásainak elemzésére. Stimuláció hatására a HaCaT sejtek képesek differenciálódni és specifikus differenciálódási markereket, például involukrint, K14-et és K10-et kifejezni. A HaCaT sejteket gyakran használják modellként is az epidermális homeosztázis patofiziológiájának tanulmányozására [6].
A HaCaT sejtek a transzplantáció után is képesek in vivo strukturált epidermiszt létrehozni, ami rétegzett epidermális struktúrát eredményez, amely a közeg kalciumkoncentrációjának változásával visszaállítható a bazális és a differenciált állapot között. Ezek a sejtek számos biológiai folyamat jellemzését is lehetővé teszik, például a D-vitamin modellrendszerként való felhasználásukat és a bőrben zajló anyagcserét. Mivel a HaCaT sejtek nem genetikailag manipuláltak, elfogulatlan képet nyújtanak az emberi bőrben zajló kezdeti genetikai események széles spektrumáról.
5. Kiemelt videók: HaCaT sejtek világának felfedezése
"HaCaT sejtvándorlás": Ez a videó a HaCaT sejtek sejtvándorlási folyamatát mutatja be. A sejtek vándorlása alapvető folyamat a különböző biológiai folyamatok, például a sebgyógyulás és a rákos áttétképződés szempontjából. A videó a HaCaT sejtek mozgását mutatja be mikroszkóp alatt, vizuálisan bemutatva, hogyan vándorolnak ezek a sejtek. A sejtek aktivitása megfigyelhető, ahogy egyik helyről a másikra mozognak, és a videó jól szemlélteti a sejtekben e folyamat során bekövetkező változásokat.
"HaCaT sejteken végzett Scratch Assay": Ez a videó egy HaCaT sejteken végzett Scratch Assay-t mutat be. A Scratch Assay egy széles körben használt technika a sejtvándorlás tanulmányozására, és ebben az esetben a HaCaT sejtek vándorlásának elemzésére használják. A videó bemutatja a folyamatot, amelynek során a sejttenyésztő edény felszínén karcolást hoznak létre, majd mikroszkóp alatt megfigyelik, ahogy a HaCaT sejtek vándorolnak és idővel bezárják a rést.
"HaCaT keratinociták sejtnövekedése sebgyógyulási kísérletekhez": Ez a videó a HaCaT keratinociták sejtnövekedésének folyamatát mutatja be sebgyógyulási kísérletekhez. A HaCaT keratinociták a sebgyógyulási vizsgálatokban gyakran használt sejtvonal.
"HaCaT sejtek differenciálása": Ez a videó bemutatja a HaCaT sejtek differenciálásához szükséges lépéseket. A HaCaT sejtek különböző típusú bőrsejtekké differenciálódhatnak. A videó bemutatja a HaCaT sejtek differenciálódása során bekövetkező változásokat, vizuálisan ábrázolva a differenciálódás különböző markereit és jellemzőit. A differenciálódási folyamat kritikus fontosságú a bőr normál működéséhez, és a videó rávilágít a HaCaT sejtek differenciálódásának különböző szakaszaira.
Hivatkozások
- Angel P és Karin M: A Jun, Fos és az AP-1 komplex szerepe a sejtproliferációban és a transzformációban. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: The regulation of epidermal hyperplastic growth. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
- Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Egy spontán keletkező, hosszú életű humán keratinocita vonal (NM-1) izolálása és jellemzése. In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
- Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53 mutations in human immortalized epithelial cell lines. Carcinogenesis 14:833-839, 1993
- Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Napfény okozta mutációs hotspotok a p53 génben a nem melanoma bőrrákoknál. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
- Fusenig NE, Boukamp P. Multiple stages and genetic alterations in immortalization, malignant transformation, and tumor progression of human skin keratinocytes. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
- Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomeráz aktivitás az emberi bőr regeneratív bazális rétegének epidermiszében, valamint halhatatlan és karcinómából származó bőrkeratinocitákban. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
- Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. HaCaT sejtek mint megbízható in vitro differenciálódási modell a humán keratinociták gyulladásos/javító válaszának feltárására. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
- Boukamp, P. et al. Normális keratinizáció egy spontán immortalizált aneuploid humán keratinocita sejtvonalban. J. Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
- Gibbs, Graham: A szaporodási folyamatok és a szaporodási folyamatok, valamint a szaporodási folyamatok és a szaporodási folyamatok között: Minőségi adatok elemzése. A Sage kvalitatív kutatási készlet. London: Sage 978-0-7619-4980-0.
- Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Alkalmazott kutatástervezés: gyakorlati útmutató. Sage: London
- Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normális keratinizáció egy spontán immortalizált aneuploid humán keratinocita sejtvonalban. Cell Biol.(1988);106:761-771.