Átfogó útmutató a sejtek fagyasztásához: Életképesség és sterilitás biztosítása

A sejtek fagyasztása kritikus folyamat a sejtkultúra-menedzsmentben, amely biztosítja az értékes sejtvonalak hosszú távú tárolását és megőrzését. Akár emberi, akár állati sejtekkel dolgozik, a pontos protokollok követése és a szigorú aszeptikus technikák betartása a sikeres krioprezerváláshoz elengedhetetlen.

Ez az útmutató részletes útmutatást nyújt a szükséges anyagokról, reagensekről és a sejtek hatékony, életképességüket és sterilitásukat megőrző fagyasztásához szükséges lépésről lépésre történő eljárásokról. Ezen irányelvek betartásával a kutatók magabiztosan tárolhatják, majd később minimális sejtéletképesség-veszteséggel újraéleszthetik a sejtkultúrákat, megőrizve kísérleti eredményeik integritását és megbízhatóságát.

Kezdetben elengedhetetlen a steril munkakörnyezet kialakítása. A megfelelő aszeptikus technikák döntő szerepet játszanak a szennyeződés megelőzésében és a tenyészetek sterilitásának biztosításában.

Aszeptikus technika

A folyamat során végig kövesse az aszeptikus technikákat a tenyészetek sterilitásának biztosítása érdekében.

Átfogó cellafagyasztási folyamat

Ez a folyamatábra részletes vizuális útmutatót nyújt a sejtek megfelelő fagyasztásának alapvető lépéseiről. Kövesse ezeket az eljárásokat a sejtek magas szintű életképességének és integritásának biztosítása érdekében a krioprezerválási folyamat során.

Fagyasztási közeg előkészítése

Készítsen krioprotektív fagyasztóközeget a sejttípusnak megfelelően:

FBS-tartalmú táptalajkultúrák: fBS + 10% DMSO vagy 70%-os növekedési táptalaj, 20% FBS és 10% DMSO
Glicerint igénylő sejtek: 90% FBS + 10% glicerin

Fontolja meg előre elkészített fagyasztási közegünk beszerzését:

CM-1 fagyasztási közeg: Szarvasmarha magzati szérumot (FBS) tartalmazó közeget igénylő protokollokhoz
CM-ACF - szérummentes fagyasztóközeg: FBS-mentes alternatíva esetén

Címkézés és dokumentáció

Címkézze fel a kriovialkat a következő adatokkal:

Dátum
A kutató neve
Sejtek száma
Passzázsszám
Sejt típusa
Bármilyen további információ (pl. genetikai módosítások)

Sejt előkészítés

Adherens sejtek esetében:

A sejtek 85-95%-os konfluencia eléréséig figyeljük a sejteket
A régi táptalajt szívja le
Öblítse le a sejtmonoréteget kalcium- és magnéziummentes PBS-szel
A sejteket Accutase, tripszin vagy tripszin-EDTA segítségével oldjuk le, és szükség esetén semlegesítsük táptalajjal
Vigye át a sejtszuszpenziót egy 50 ml-es Falcon-csőbe

Szuszpenziós sejtek esetén:

Ellenőrizze a sejtsűrűséget és a sejtek egészségét mikroszkóp alatt
A sejtszuszpenziót közvetlenül 50 ml-es Falcon-csőbe helyezzük át

Sejtszámlálás és centrifugálás

Számolja meg a sejteket hemocitométerrel vagy automatikus sejtszámlálóval
A sejtek pelletálásához centrifugáljon 300 g-nél 3-5 percig szobahőmérsékleten
Óvatosan szívja le a felülúszót, elkerülve a sejtpellet megzavarását
Használat előtt melegítse fel az elkészített fagyasztási tápfolyadékot 37 °C-ra

Kriokonzerválás

Rezuszpendálja a sejtpelletet fagyasztási tápfolyadékban 2,0 millió sejt/ml sűrűségűre tapadó sejtek esetén és 5 millió sejt/ml sűrűségűre szuszpenziós sejtek esetén, vagy a kívánt koncentrációra
Aliquotáljon 1,0 mL (vagy szükség szerint többet) a sejtszuszpenzióból címkével ellátott kriovialis üvegekbe
Használjon lassú fagyasztási módszert, mielőtt a sejteket hosszú távú tárolásra átviszi

? Módszer	? Lépések
❄️ Kézi fagyasztás	1️⃣ Helyezze a sejteket fagyasztóközegbe 4 °C-os fagyasztóban 40 percre. 2️⃣ Tegyük át -80°C-os fagyasztóba 24 órára. 3️⃣ A sejteket hosszú távú megőrzés céljából tárolja folyékony nitrogénben
? Mr. Frosty használata	1️⃣ Készítse elő a sejteket fagyasztóközeggel ellátott kriovialis üvegekben. 2️⃣ Helyezze a kriovialis üvegeket a Mr. Frosty tartályba. 3️⃣ Tárolja -80°C-on 24 órán keresztül, mielőtt átrakja folyékony nitrogénbe
? Szabályozott sebességű fagyasztó	1️⃣ Programozza a készüléket a hőmérséklet fokozatos csökkentésére. 2️⃣ Helyezze az előkészített sejteket a fagyasztóba. 3️⃣ A fagyasztási ciklus után helyezze át a sejteket folyékony nitrogénbe

Tárolja a kriovialisokat -130°C alatti hőmérsékleten vagy folyékony nitrogénben a hosszú távú megőrzés érdekében.

Anyagok és reagensek

1-2 ml-es kriovialis fiolák
CoolCell® fagyasztóegység vagy szabályozott sebességű fagyasztógép
Krioprotektív fagyasztási közeg (pl. DIY krioprotektív közeg, CM-1, CM-ACF vagy speciális közeg)
Szarvasmarha magzati szérum (FBS) vagy kondicionált médiumok
DMSO vagy glicerin
Kalcium- és magnéziummentes PBS
Accutáz, tripszin vagy tripszin-EDTA (tapadó sejtekhez)
15 ml-es vagy 50 ml-es Falcon-csövek
Hemocitométer vagy automatikus sejtszámláló
Centrifuga