Közzététel: 2023 | Utolsó felülvizsgálat: 2026. május

Átfogó útmutató a sejtek fagyasztásához: az életképesség és a sterilitás biztosítása

A sejtek fagyasztása a sejtkultúra-kezelés kritikus folyamata, amely biztosítja az értékes sejtvonalak hosszú távú tárolását és megőrzését. Akár emberi, akár állati sejtekkel dolgozunk, a pontos protokollok betartása és a szigorú aszeptikus technikák alkalmazása elengedhetetlen a sikeres kriokonzerváláshoz.

Ez az útmutató részletes utasításokat tartalmaz a szükséges anyagokról, reagensekről és a lépésről lépésre végrehajtandó eljárásokról, amelyekkel hatékonyan lehet a sejteket fagyasztani, miközben megőrzik azok életképességét és sterilitását. Ezen irányelvek betartásával a kutatók magabiztosan tárolhatják és később újraéleszthetik a sejtkultúrákat a sejtek életképességének minimális veszteségével, megőrizve kísérleti eredményeik integritását és megbízhatóságát.

Először is elengedhetetlen a steril munkakörnyezet kialakítása. A megfelelő aszeptikus technikák döntő szerepet játszanak a szennyeződés megelőzésében és a tenyészetek sterilitásának biztosításában.

Aseptikus technika

A tenyészetek sterilitásának biztosítása érdekében az egész folyamat során kövesse az aszeptikus technikákat.

Átfogó sejtfagyasztási folyamat

Ez a folyamatábra részletes vizuális útmutatást nyújt a sejtek megfelelő fagyasztásához szükséges alapvető lépésekről. Kövesse ezeket az eljárásokat a sejtek magas életképességének és integritásának biztosítása érdekében a kriokonzerválási folyamat során.

Fagyasztóközeg előkészítése

Készítse elő a krioprotektív fagyasztó közeget a sejttípusnak megfelelően:

FBS-tartalmú tenyészközeg: 90% FBS + 10% DMSO vagy 70% növekedési közeg, 20% FBS és 10% DMSO
Glicerint igénylő sejtek: 90% FBS + 10% glicerin

Fontolja meg előre elkészített fagyasztó közegünk beszerzését:

CM-1 fagyasztóközeg: olyan protokollokhoz, amelyek magzati borjú szérumot (FBS) tartalmazó közeget igényelnek
CM-ACF fagyasztó tápközeg – szérummentes: FBS-mentes alternatíva

Címkézés és dokumentáció

Címkézze fel a kriovialákat a következő adatokkal:

Dátum
A kutató neve
Sejtszám
Passzázs száma
Sejttípus
Bármilyen további információ (pl. genetikai módosítások)

Sejtek előkészítése

Adherens sejtek esetében:

Figyelje a sejteket, amíg el nem érik a 85–95%-os konfluenciát
Szívja le a régi tenyészköze
Öblítse le a sejtmonoréteget kalcium- és magnéziummentes PBS-sel
Válasszuk le a sejteket Accutase-szal, tripszinnel vagy tripszin-EDTA-val, és szükség esetén semlegesítsük tenyészközeggel
Helyezze át a sejtszuszpenziót egy 50 ml-es Falcon csőbe

Szuszpenziós sejtek esetében:

Ellenőrizze a sejtsűrűséget és az állapotot mikroszkóp alatt
A sejtszuszpenziót közvetlenül egy 50 ml-es Falcon csőbe helyezzük át

Sejtszámlálás és centrifugálás

Számolja meg a sejteket hemocitométer vagy automatikus sejtszámláló segítségével
Centrifugálja 300 g-vel 3-5 percig szobahőmérsékleten a sejtek leülepedéséhez
Óvatosan szívja le a felülúszót, ügyelve arra, hogy ne zavarja meg a sejtpelletet
Használat előtt melegítse az előkészített fagyasztóközeget 37 °C-ra

Kriokonzerválás

A sejtpelletet felfüggesztjük a fagyasztó közegben 2,0 millió sejt/ml sűrűségre az adhezív sejtek esetében, és 5 millió sejt/ml sűrűségre a szuszpenziós sejtek esetében, vagy a kívánt koncentrációra
1,0 ml (vagy szükség szerint több) sejtszuszpenziót osztunk fel címkézett kriovialákba
A sejtek hosszú távú tárolásra való átvitelét megelőzően alkalmazzon lassú fagyasztási módszert

? Módszer: ? Lépések
❄️ Kézi fagyasztás: 1️⃣ Helyezze a sejteket fagyasztóközegbe, és tegye 40 percre 4 °C-os fagyasztóba.
2️⃣ Helyezze át -80 °C-os fagyasztóba 24 órára.
3️⃣ Hosszú távú tároláshoz tárolja a sejteket folyékony nitrogénben.
? Mr. Frosty használata: 1️⃣ Készítse elő a sejteket fagyasztóközeggel ellátott kriovialákban.
2️⃣ Helyezze a kriovialákat a Mr. Frosty tartályba.
3️⃣ Tárolja -80 °C-on 24 órán át, mielőtt folyékony nitrogénbe helyezi át.
? Szabályozott hőmérsékletű fagyasztó: 1️⃣ Állítsa be a készüléket úgy, hogy a hőmérséklet fokozatosan csökkenjen.
2️⃣ Helyezze az előkészített sejteket a fagyasztóba.
3️⃣ A fagyasztási ciklus után helyezze át a sejteket folyékony nitrogénbe.

A kriovialákat -130 °C alatti hőmérsékleten vagy folyékony nitrogénben tárolja hosszú távú megőrzés céljából.

Anyagok és reagensek

1–2 ml-es kriovialák
CoolCell® fagyasztóegység vagy szabályozott hőmérsékletű fagyasztó
Krioprotektív fagyasztóközeg (pl. saját készítésű krioprotektív közeg, CM-1, CM-ACF vagy speciális közeg)
Borjú szérum (FBS) vagy kondicionált közeg
DMSO vagy glicerin
Kalcium- és magnéziummentes PBS
Accutase, tripszin vagy tripszin-EDTA (adherens sejtekhez)
15 ml-es vagy 50 ml-es Falcon csövek
Hemocitométer vagy automatikus sejtszámláló
Centrifuga