Közzététel: 2023 | Utolsó felülvizsgálat: 2026. május

Sejtkultúra-diszociációs technikák

A sejtkultúra diszociációja a sejtkultúra fenntartásának kritikus lépése. Ez magában foglalja a sejtek leválasztását a növekedési felületről, hogy lehetővé váljon az átültetés vagy a betakarítás. Ez a szakasz két fő módszert ismertet: az enzimmentes diszociációs pufferek és az enzimatikus reagensek használatát.

Enzimmentes sejtdiszociációs pufferek használata

Ez a módszer kíméletes, és enzimek használata nélkül megőrzi a sejtek integritását:

1. Előkészítés
   • A sejtek sokkjának elkerülése érdekében használat előtt győződjön meg arról, hogy minden reagens 37 °C-ra felmelegedett.
2. A tenyészközeg eltávolítása:
   • A régi tenyészközeget ki kell üríteni a tenyésztőedényből.
3. Öblítés
   • Öblítse le a sejtmonorétegeket 5 ml kalcium- és magnéziummentes PBS-sel T75-ös lombik vagy 100 mm-es tálonként.
   • Óvatosan rázza a tartályt 30–60 másodpercig szobahőmérsékleten.
   • Szívja le és dobja ki az öblítőoldatot.
   • Ismételje meg ezt az öblítési lépést még egyszer.
4. Diszociáció
   • Adjon hozzá körülbelül 5 ml enzimmentes sejtdiszociációs puffert az edénybe.
   • Óvatosan rázza szobahőmérsékleten 1–2 percig, majd mikroszkóp alatt ellenőrizze a disszociációt.
   • Szükség esetén kopogtassa meg a lombikot vagy a tálcát a kezével, hogy a sejtek leváljanak.
   • Ha a sejtek tapadnak, hagyja őket további 2–5 percig szobahőmérsékleten állni, és szükség esetén ismét kopogassa meg, több disszociációs puffert használva.
   • Miután a sejtek leváltak, adjon hozzá legalább 5 ml teljes tenyésztőközeget a diszociációs puffer semlegesítéséhez és a sejtek reszuszpendálásához.
5. Életképesség ellenőrzése
   • Figyelje a sejtek életképességét az átoltás során, és gondoskodjon arról, hogy az 90% felett maradjon.

Más reagensek használata a disszociációhoz

Ez a módszer lehetővé teszi különböző diszociációs reagensek használatát:

1. A használt tápközeg eltávolítása
   • A régi táptalajt dobja ki a tenyésztőedényből.
2. A sejtek mosása
   • Mossa le a sejteket kalcium- és magnéziummentes, kiegyensúlyozott sóoldattal, vagy használjon EDTA-t.
   • Óvatosan adagolja az öblítőoldatot a sejtekkel szemközti oldalra, és 1–2 percig rázza az edényt, mielőtt az öblítőoldatot kiürítené.
3. Diszociáció
   • Adjon hozzá 2–3 ml választott disszociációs oldatot 25 cm² tenyésztési felületre, ügyelve arra, hogy az egész sejtréteget lefedje.
   • Inkubálja az edényt 37 °C-on, és óvatosan rázza meg. A disszociáció általában 5–15 percen belül megtörténik, a sejtvonal függvényében.
   • A makacs sejtek esetében az edény megkopogtatása felgyorsíthatja a folyamatot.
   • Gondosan figyelje a sejteket, hogy elkerülje a túlzott expozíciót és az esetleges károsodást.
4. Sejtek begyűjtése
   • Miután a sejtek teljesen leváltak, állítsa a tartályt függőleges helyzetbe, hogy a sejtek az aljára gyűljenek.
   • Adjon hozzá teljes táptalajt, majd pipettával szórja szét és gyűjtse össze a sejteket a sejtréteg felett.
   • Számolja meg a sejteket, majd folytassa az átültetéssel.

Mindkét módszer esetében fontos, hogy empirikus megfigyelések alapján meghatározzuk az egyes sejtvonalak optimális feltételeit. A folyamatnak meg kell őriznie a sejtek életképességét, amelyet az átültetés során rendszeresen ellenőrizni kell, hogy meghaladja a 90%-ot. Ezek az eljárások alapot nyújtanak a kutatók számára, hogy azokat a sejtvonalak sajátos követelményeihez és jellemzőihez igazítsák.

Az adhezív sejtek szubkultiválásának technikáinak áttekintése

Az adhezív sejtek hatékony szubkultiválásához el kell választani őket a tenyésztőedénytől. Különböző módszereket alkalmaznak, amelyek mindegyike különböző sejttípusokhoz és körülményekhez alkalmas. A disszociációs módszer kiválasztásakor elengedhetetlen figyelembe venni a sejtvonal specifikus igényeit és a kísérlet céljait. A tenyészet folyamatos egészségének és termelékenységének fenntartásához elengedhetetlen a sejtek életképességének rendszeres figyelemmel kísérése, azzal a céllal, hogy az átültetéskor az életképesség meghaladja a 90%-ot. Az alábbiakban áttekintjük ezeket az eljárásokat: