Sejtkultúra-diszszociációs technikák

A sejtkultúra-diszszociáció a sejtkultúra fenntartásának kritikus lépése. Ez magában foglalja a sejtek leválasztását a növekedési felületükről, hogy lehetővé tegye a szubkultúrát vagy a betakarítást. Ez a szakasz két fő módszert ismertet: az enzimmentes disszociációs pufferek és az enzimatikus reagensek használatát.

1.enzimmentes sejtdissociációs pufferek használata

Ez a módszer kíméletes és enzimek használata nélkül is megőrzi a sejtek integritását:

1. Előkészítés
   • A sejtek sokkhatásának elkerülése érdekében használat előtt minden reagenset 37 °C-ra kell felmelegíteni.
2. A növekedési médium eltávolítása
   • Dobja ki a régi táptalajt a tenyésztőedényből.
3. Öblítés
   • Öblítse le a sejtmonolayereket T75-ös lombikonként vagy 100 mm-es tányéronként 5 ml kalcium- és magnéziummentes PBS-szel.
   • Óvatosan ringassa az edényt 30-60 másodpercig szobahőmérsékleten.
   • Szívja le és dobja el az öblítőoldatot.
   • Ismételje meg ezt az öblítési lépést még egyszer.
4. Dissociáció
   • Adjunk körülbelül 5 ml enzimmentes sejtdiszszociációs puffert az edénybe.
   • Óvatosan ringassa szobahőmérsékleten 1-2 percig, és ellenőrizze a disszociációt mikroszkóp alatt.
   • Ha szükséges, a sejtek eltávolítása érdekében ütögesse a lombikot vagy az edényt a kezéhez.
   • Ha a sejtek megtapadtak, hagyjuk őket további 2-5 percig szobahőmérsékleten állni, és ha szükséges, ismét kopogtassuk meg őket, több disszociációs pufferrel.
   • Ha a sejtek leváltak, adjunk hozzá legalább 5 ml teljes tápfolyadékot a disszociációs puffer semlegesítéséhez, és szuszpendáljuk újra a sejteket.
5. Életképesség ellenőrzése
   • A sejtek életképességét a szubkultiválás során ellenőrizze, hogy az 90% felett maradjon.

2.egyéb reagensek használata a disszociációhoz

Ez a módszer lehetővé teszi különböző disszociációs reagensek használatát:

1. A felhasznált médium eltávolítása
   • Dobja ki a régi médiumot a tenyésztőedényből.
2. A sejtek mosása
   • A sejteket kalcium- és magnéziummentes, kiegyensúlyozott sóoldattal mossuk ki, vagy használjunk EDTA-t.
   • Óvatosan adagolja a mosóoldatot a sejtekkel szemben lévő oldalra, és a mosás eldobása előtt 1-2 percig ringassa az edényt.
3. Dissociáció
   • Adjunk 2-3 ml-t a kiválasztott disszociációs oldatból 25 cm² növekedési felületre, biztosítva a sejtlap fedettségét.
   • Inkubáljuk az edényt 37°C-on, és óvatosan ringassuk. A disszociáció a sejtvonaltól függően általában 5-15 percen belül bekövetkezik.
   • Makacs sejtek esetén az edény megkopogtatása felgyorsíthatja a folyamatot.
   • Figyelmesen figyelje a sejteket, hogy elkerülje a túlzott expozíciót és az esetleges károsodást.
4. A sejtek kinyerése
   • Miután a sejtek teljesen leváltak, hagyja, hogy az edény alján összegyűljenek, ha az edényt függőlegesen állítja.
   • Adjon hozzá teljes tápfolyadékot, majd diszpergálja és gyűjtse össze a sejteket a sejtréteg fölött pipettázva.
   • Számolja meg és folytassa a szubkultiválást.

Mindkét módszer esetében fontos, hogy empirikus megfigyeléssel határozzuk meg az egyes sejtvonalak számára optimális körülményeket. A folyamatnak meg kell őriznie a sejtek életképességét, amelyet rutinszerűen ellenőrizni kell, hogy a szubkultiválás során meghaladja a 90%-ot. Ezek az eljárások alapot nyújtanak a kutatók számára, hogy a sejtvonalaik sajátos követelményei és jellemzői alapján adaptálják azokat.

3.az adherens sejtek szubkultiválási technikáinak áttekintése

Az adherens sejtek hatékony szubkultiválása megköveteli a sejtek leválasztását a tenyésztőedényről. Különböző módszereket alkalmaznak, amelyek mindegyike különböző sejttípusokhoz és körülményekhez alkalmas. A leválasztási módszer kiválasztásakor döntő fontosságú, hogy figyelembe vegyük a sejtvonal sajátos igényeit és a kísérlet céljait. A sejtek életképességének rendszeres ellenőrzése, amelynek célja, hogy a sejtek életképessége a szubkultiválás időpontjában 90%-nál nagyobb legyen, elengedhetetlen a kultúra folyamatos egészségének és termelékenységének biztosítása érdekében. Az alábbiakban áttekintjük ezeket az eljárásokat: