HaCaT-celler

1. Kassér det gamle medium: Fjern forsigtigt det gamle dyrkningsmedium fra kolberne.
2. Vask cellerne: Tilsæt 3-5 ml fosfatbufferet saltvand (PBS) uden calcium og magnesium til T25-kolberne eller 5-10 ml til T75-kolberne for at skylle de vedhæftede celler.
3. Tilsæt EDTA-opløsning: Dæk cellelaget helt med en frisklavet 0,05 % EDTA-opløsning. Brug 1-2 ml til T25-kolber og 2,5 ml til T75-kolber.
4. Inkubér: Inkubér kolberne ved 37 °C i 10 minutter.
5. Tilsæt Trypsin/EDTA eller TrypLE Express-opløsning: Efter inkubation tilsættes en frisklavet trypsin/EDTA-opløsning (0,05 % trypsin, 0,025 % EDTA) eller TrypLE Express til kolberne, så cellelaget er helt dækket. Brug 1 ml til T25-kolber og 2,5 ml til T75-kolber. (Bemærk: Trin 3 og 4 kan udelades, hvis du bruger TrypLE Express)
6. Overvåg løsrivelsen: Observer cellerne under et mikroskop. Cellerne bør løsne sig inden for 1-5 minutter.
7. Neutraliser trypsin: Tilsæt cellekulturmedium, der indeholder føtalt bovint serum (FBS), for at neutralisere trypsinaktiviteten, så snart cellerne har løsnet sig.
8. Overfør celler: Fordel cellesuspensionen i nye kolber, der er fyldt med frisk dyrkningsmedium.

1. Bekræft, at hætteglasset forbliver dybfrosset ved levering, da cellerne sendes på tøris for at opretholde optimale temperaturer under transport.

2. Ved modtagelsen skal du enten straks opbevare kryohætteglasset ved temperaturer under -150 °C for at sikre, at cellernes integritet bevares, eller gå videre til trin 3, hvis øjeblikkelig dyrkning er påkrævet.

3. Ved øjeblikkelig dyrkning optøs hætteglasset hurtigt ved at nedsænke det i et 37 °C varmt vandbad med rent vand og et antimikrobielt middel og røre forsigtigt i 40-60 sekunder, indtil der kun er en lille isklump tilbage.

4. Udfør alle efterfølgende trin under sterile forhold i en flowhætte, og desinficer kryovialet med 70 % ethanol, før det åbnes.

5. Åbn forsigtigt det desinficerede hætteglas, og overfør cellesuspensionen til et 15 ml centrifugerør, der indeholder 8 ml kulturmedium ved stuetemperatur, og bland forsigtigt.

6. Centrifuger blandingen ved 300 x g i 3 minutter for at adskille cellerne, og kassér omhyggeligt supernatanten, der indeholder resterende frysemedium.

7. Resuspender forsigtigt cellepelleten i 10 ml frisk dyrkningsmedium. For klæbende celler deles suspensionen mellem to T25-kulturkolber; for suspensionskulturer overføres alt mediet til en T25-kolbe for at fremme effektiv celleinteraktion og -vækst.

8. Overhold etablerede subkulturprotokoller for fortsat vækst og vedligeholdelse af cellelinjen, hvilket sikrer pålidelige eksperimentelle resultater.

37°C, 5%_CO2, befugtet atmosfære.

For at opnå optimal vedhæftning og levedygtighed efter optøning anbefaler vi at bruge kollagenbelagte kolber eller plader.

Kryopræserverede cellelinjer sendes på tøris i valideret, isoleret emballage med tilstrækkeligt kølemiddel til at opretholde ca. -78 °C under hele transporten. Ved modtagelse skal beholderen straks inspiceres, og hætteglassene skal straks overføres til passende opbevaring.

Kryopræserverede cellelinjer sendes på tøris i valideret, isoleret emballage med tilstrækkeligt kølemiddel til at opretholde ca. -78 °C under hele transporten. Ved modtagelse skal beholderen straks inspiceres, og hætteglassene skal straks overføres til passende opbevaring.

For langtidsopbevaring anbringes hætteglas i flydende nitrogen i dampfase ved ca. -150 til -196 °C. Opbevaring ved -80 °C er kun acceptabelt som et kort mellemtrin før overførsel til flydende nitrogen.

Mycoplasma-kontaminering udelukkes ved hjælp af både PCR-baserede assays og luminescensbaserede mycoplasma-detektionsmetoder.

For at sikre, at der ikke er nogen bakterie-, svampe- eller gærforurening, underkastes cellekulturerne daglige visuelle inspektioner.