Células U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1

800,00 €*

Os produtos são enviados congelados em gelo seco em criotubos. Cada criotubo contém normalmente 3 × 10^⁶ células para linhas aderentes ou 5 × 10^⁶ células para linhas em suspensão (consulte o CoA do lote para obter detalhes).

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cryovial

Número do produto: 300664

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Descrição	U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1 é uma linha celular de osteossarcoma humano editada geneticamente, derivada de células U2OS, nas quais o gene endógeno SEH1L (SEH1) foi modificado usando a tecnologia CRISPR/Cas9 para codificar uma etiqueta SNAPf em quadro. O SEH1 é um componente do complexo Y (também conhecido como complexo NUP107-160), um módulo estrutural central do complexo de poros nucleares (NPC) que contribui para a montagem e estabilidade da estrutura dos poros. Ao inserir a sequência de codificação SNAPf no locus endógeno, a proteína SEH1 marcada é expressa sob controlo regulatório nativo, preservando os níveis de expressão fisiológica e minimizando as perturbações na composição dos poros nucleares. A etiqueta SNAPf é uma variante projetada e de reação rápida da etiqueta SNAP que se liga covalentemente a substratos conjugados com benzilguanina, permitindo a marcação fluorescente seletiva e estável em células vivas ou fixas. Nas células U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1, a proteína de fusão localiza-se no envelope nuclear num padrão pontilhado característico da distribuição do NPC. Como a marcação ocorre em níveis de proteína endógena, este sistema é adequado para microscopia de fluorescência quantitativa, imagens de super-resolução e análises de rastreamento de partículas únicas com o objetivo de dissecar a organização e a estequiometria do NPC. A morfologia plana e os núcleos grandes das células U2OS facilitam ainda mais a visualização de alta resolução das estruturas do envelope nuclear. A SEH1 participa na biogênese do NPC e também tem sido implicada em processos associados ao cinetocoro durante a mitose. Assim, esta linha celular fornece uma plataforma robusta para investigar a montagem e desmontagem do NPC dependente do ciclo celular, a organização espacial do complexo Y dentro da estrutura do poro e os potenciais papéis duplos da SEH1 no envelope nuclear e nos cinetocoros mitóticos. O U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1 permite estudos mecanísticos da arquitetura e dinâmica dos poros nucleares em condições de expressão fisiologicamente relevantes.
Organismo	Humano
Tecido	Osso
Doença	Osteossarcoma

Idade	15 anos
Género	Feminino
Etnia	Caucasiano
Morfologia	De tipo epitelial
Propriedades de crescimento	Aderente

Citação	U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1 (número de catálogo Cytion 300664)
Nível de biossegurança	1
NCBI_TaxID	9606
Depositor	O Laboratório Ellenberg (EMBL)
Estatuto dos OGM	GMO-S1: Esta linha celular de osteossarcoma humano (U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1) contém uma fusão SNAPf-SEH1 mediada por CRISPR que permite a marcação selectiva da nucleoporina SEH1. A modificação está presente de forma estável. Esta classificação aplica-se apenas na Alemanha e pode diferir noutros países.

Expressão proteica	SEH1, SNAPf-tag

Meio de cultura	McCoys 5a, com: 3,0 g/L de glucose, com: glutamina estável, com: 2,0 mM de piruvato de sódio, com: 2,2 g/L de NaHCO3 (número de artigo Cytion 820200a)
Suplementos	Suplementar o meio com 10% de FBS, 3,0 g/L de glucose, glutamina estável, 2,0 mM de piruvato de sódio, 2,2 g/L de NaHCO3, 1% de NEAA
Reagente de dissociação	Accutase
Subcultura	Retirar o meio antigo das células aderentes e lavá-las com PBS sem cálcio e magnésio. Nos frascos T25, utilizar 3-5 ml de PBS e, nos frascos T75, 5-10 ml. Em seguida, cobrir completamente as células com Accutase, utilizando 1-2 ml para os frascos T25 e 2,5 ml para os frascos T75. Deixar as células incubar à temperatura ambiente durante 8-10 minutos para as destacar. Após a incubação, misturar suavemente as células com 10 ml de meio para as ressuspender e, em seguida, centrifugar a 300xg durante 3 minutos. Deitar fora o sobrenadante, ressuspender as células em meio fresco e transferi-las para novos frascos que já contenham meio fresco.
Congelar o meio	Como meio de criopreservação, utilizamos um meio de crescimento completo (incluindo FBS) + 10% DMSO para uma viabilidade pós-descongelamento adequada, ou CM-1 (número de catálogo Cytion 800100), que inclui osmoprotectores optimizados e estabilizadores metabólicos para melhorar a recuperação e reduzir o stress induzido pela crio.
Descongelamento e cultura de células	Confirme que o frasco permanece profundamente congelado aquando da entrega, uma vez que as células são enviadas em gelo seco para manter as temperaturas ideais durante o transporte. Após a receção, armazenar o frasco criogénico imediatamente a temperaturas inferiores a -150°C para garantir a preservação da integridade celular, ou avançar para o passo 3 se for necessária uma cultura imediata. Para uma cultura imediata, descongelar rapidamente o frasco imergindo-o num banho de água a 37°C com água limpa e um agente antimicrobiano, agitando suavemente durante 40-60 segundos até ficar um pequeno aglomerado de gelo. Efetuar todos os passos subsequentes em condições estéreis numa capela de fluxo, desinfectando o frasco criogénico com etanol a 70% antes de o abrir. Abrir cuidadosamente o frasco desinfectado e transferir a suspensão de células para um tubo de centrifugação de 15 ml contendo 8 ml de meio de cultura à temperatura ambiente, misturando suavemente. Centrifugar a mistura a 300 x g durante 3 minutos para separar as células e eliminar cuidadosamente o sobrenadante que contém o meio de congelação residual. Ressuspender suavemente o pellet de células em 10 ml de meio de cultura fresco. No caso de células aderentes, dividir a suspensão entre dois frascos de cultura T25; no caso de culturas em suspensão, transferir todo o meio para um frasco T25 para promover uma interação e um crescimento eficazes das células. Cumprir os protocolos de subcultura estabelecidos para o crescimento e manutenção contínuos da linha celular, garantindo resultados experimentais fiáveis.
Atmosfera de incubação	37°C, 5%_CO2, atmosfera humidificada.
Revestimento de frascos	Para uma fixação e viabilidade óptimas após a descongelação, recomendamos a utilização de frascos ou placas revestidos com colagénio.
Procedimento de congelação	As linhas celulares criopreservadas são expedidas em gelo seco em embalagens validadas e isoladas com refrigerante suficiente para manter aproximadamente -78 °C durante o transporte. Aquando da receção, inspecionar imediatamente o recipiente e transferir sem demora os frascos para um local de armazenamento adequado.
Condições de envio	As linhas celulares criopreservadas são expedidas em gelo seco em embalagens validadas e isoladas com refrigerante suficiente para manter aproximadamente -78 °C durante o transporte. Aquando da receção, inspecionar imediatamente o recipiente e transferir sem demora os frascos para um local de armazenamento adequado.
Condições de armazenamento	Para conservação a longo prazo, colocar os frascos em azoto líquido em fase de vapor a uma temperatura entre -150 e -196 °C. O armazenamento a -80 °C é aceitável apenas como um curto passo intermédio antes da transferência para azoto líquido.

Esterilidade	A contaminação por micoplasma é excluída utilizando ensaios baseados em PCR e métodos de deteção de micoplasma baseados em luminescência. Para garantir que não há contaminação bacteriana, fúngica ou de leveduras, as culturas de células são sujeitas a inspecções visuais diárias.

Note-se que esta linha celular não está disponível ao abrigo de um MTA Cytion normalizado, uma vez que requer um acordo com terceiros e/ou está sujeita a negociação com o licenciante original.

Células U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1

Informações gerais

Caraterísticas

Dados regulamentares

Dados biomoleculares

Manuseamento

Controlo de qualidade / Perfil genético / HLA

Acordo com terceiros