HaCaT šūnas

1. Izmetiet veco mediju: No kolbām uzmanīgi izņemiet veco barotni.
2. Izskalojiet šūnas: Lai izskalotu pielipušās šūnas, T25 kolbām pievienot 3-5 ml ar fosfātu buferēta fizioloģiskā šķīduma (PBS) bez kalcija un magnija vai 5-10 ml T75 kolbām.
3. Pievienot EDTA šķīdumu: Šūnu slāni pilnībā pārklājiet ar svaigi sagatavotu 0,05 % EDTA šķīdumu. T25 kolbām izmantot 1-2 ml, bet T75 kolbām - 2,5 ml.
4. Inkubēt: 10 minūtes inkubēt kolbas 37 °C temperatūrā.
5. Pievienojiet tripsīna/EDTA vai TrypLE Express šķīdumu: Pēc inkubācijas kolbām pievieno svaigi sagatavotu tripsīna/EDTA šķīdumu (0,05 % tripsīns, 0,025 % EDTA) vai TrypLE Express šķīdumu, nodrošinot, ka šūnu slānis ir pilnībā pārklāts. Izmantojiet 1 ml T25 kolbām un 2,5 ml T75 kolbām. (Piezīme. 3. un 4. darbību var neveikt, ja izmanto TrypLE Express.)
6. Uzraudzīt atdalīšanos: Novērot šūnas mikroskopā. Šūnām jāatdalās 1-5 minūšu laikā.
7. Neitralizēt tripsīnu: Lai neitralizētu tripsīna aktivitāti, tiklīdz šūnas ir atdalījušās, pievienojiet šūnu kultūras barotni, kas satur fetālo liellopu serumu (FBS).
8. Pārnest šūnas: Šūnu suspensiju iepildīt jaunās kolbās, kas iepriekš piepildītas ar svaigu barotni.

1. Pārliecinieties, ka pēc piegādes flakons paliek dziļi sasaldēts, jo šūnas tiek sūtītas uz sausā ledus, lai pārvadāšanas laikā saglabātu optimālu temperatūru.

2. Pēc saņemšanas vai nu nekavējoties uzglabāt kriovialu temperatūrā, kas zemāka par -150 °C, lai nodrošinātu šūnu integritātes saglabāšanu, vai arī turpināt 3. posmu, ja nepieciešama tūlītēja kultivēšana.

3. Tūlītējas kultivēšanas gadījumā ātri atkausējiet flakonu, iegremdējot to 37°C ūdens vannā ar tīru ūdeni un antibakteriālu līdzekli, viegli maisot 40-60 sekundes, līdz paliek neliels ledus gabaliņš.

4. Visas turpmākās darbības veiciet sterilos apstākļos plūsmas nosūcējā, pirms atvēršanas dezinficējot kriovialu ar 70% etanolu.

5. Uzmanīgi atveriet dezinficēto flakonu un pārnesiet šūnu suspensiju 15 ml centrifūgas mēģenē, kurā ir 8 ml istabas temperatūras barotnes, uzmanīgi samaisot.

6. Centrifugējiet maisījumu ar 300 x g 3 minūtes, lai atdalītu šūnas, un uzmanīgi izmetiet virskārtu, kas satur saldēšanas barotnes atlikumus.

7. Viegli resuspendēt šūnu granulas 10 ml svaigas barotnes. Adhēzijas šūnu gadījumā suspensiju sadalīt divās T25 kolbās; suspensijas kultūrām visu barotni pārnest vienā T25 kolbā, lai veicinātu efektīvu šūnu mijiedarbību un augšanu.

8. Ievērojiet noteiktos subkultūru protokolus, lai nodrošinātu nepārtrauktu šūnu līnijas augšanu un uzturēšanu, tādējādi nodrošinot uzticamus eksperimentu rezultātus.

37°C, 5%_CO2, mitrināta atmosfēra.

Optimālai piestiprināšanai un dzīvotspējai pēc atkausēšanas ieteicams izmantot ar kolagēnu pārklātas kolbas vai plates.

Kriokonservētas šūnu līnijas tiek sūtītas uz sausā ledus apstiprinātā, izolētā iepakojumā ar pietiekamu dzesēšanas šķidruma daudzumu, lai visā transportēšanas laikā uzturētu aptuveni -78 °C temperatūru. Pēc saņemšanas nekavējoties pārbaudiet iepakojumu un nekavējoties pārvietojiet flakonus uz atbilstošu uzglabāšanas vietu.

Kriokonservētas šūnu līnijas tiek sūtītas uz sausā ledus apstiprinātā, izolētā iepakojumā ar pietiekamu dzesēšanas šķidruma daudzumu, lai visā transportēšanas laikā uzturētu aptuveni -78 °C temperatūru. Pēc saņemšanas nekavējoties pārbaudiet iepakojumu un nekavējoties pārvietojiet flakonus uz atbilstošu uzglabāšanas vietu.

Ilgstošai uzglabāšanai flakonus ievietojiet šķidrā slāpeklī ar tvaika fāzi aptuveni -150 līdz -196 °C temperatūrā. Uzglabāšana -80 °C temperatūrā ir pieļaujama tikai kā īss starpposms pirms pārvietošanas uz šķidro slāpekli.

Mikoplazmas piesārņojums tiek izslēgts, izmantojot gan uz PCR balstītus testus, gan uz luminiscenci balstītas mikoplazmas noteikšanas metodes.

Lai pārliecinātos, ka nav baktēriju, sēnīšu vai rauga piesārņojuma, šūnu kultūras katru dienu vizuāli pārbauda.