HaCaT細胞 - 皮膚生物学と疾患の探求
HaCaT細胞は、ヒト表皮ケラチノサイトに由来し、表皮のホメオスタシスと関連する病態を研究するために一般的に使用されている。この細胞は、自然発生的に不死化されたヒトのケラチノサイトと考えられており、危機や成長遅延に遭遇することなく正常な皮膚のケラチノサイトから誘導されたという点で注目に値する。このユニークな起源により、HaCaT細胞は他の細胞株とは異なる一連の遺伝的および増殖的特性を持つようになった。試験管内で形質転換した表現型を示し、寒天やプラスチック上でクローン形成特性を示すにもかかわらず、HaCaT細胞株は腫瘍形成性を示さない。正常な分化を示す成人ヒト皮膚由来の最初の安定した上皮細胞株であるHaCaT細胞は、ヒト細胞における角化の制御を研究するための貴重なツールである。これらの細胞は、in vitroで効果的に増殖・分化する能力を持つため、幅広い応用が可能である。
1.HaCaT細胞の特徴
HaCaT細胞は、低カルシウム条件下で培養することができ、同じ条件下で維持される初代細胞のように、細胞間のタイトジャンクションを欠いた紡錘形の外観を持つ。正常な表皮では、ケラチノサイトは基底層の幹細胞から発生し、有棘層、顆粒層を経て角膜層に達し、環境に脱落する。このように増殖と落屑のバランスは厳密に制御されており、その結果、角化として知られる複雑な過程を経て、28日ごとに完全に更新または変化する。このプロセスは高度に制御されており、遺伝子発現、構造設計、酵素活性の著しい変化を伴う。in vitroおよびin vivoでの解析のためには、HaCaT細胞はヒト表皮細胞の分化層に特徴的な表皮ケラチンを維持しなければならず、これは皮膚の構造的完全性と弾力性の維持に不可欠である。HaCaT細胞では連続的な染色体変化が起こりうるが、それらは重要な分化の問題とは関連せず、むしろ試験管内でのヒト成体ケラチノサイトの自然な形質転換を示しているのかもしれない。
2.HaCaT細胞の遺伝的特徴と起源
HaCaT細胞は、成人の皮膚に由来する自然発生的に不死化したヒトケラチノサイト細胞株であり、ユニークな進化経路を代表する。これらの細胞はp53遺伝子の両アレルに変異を有しており、これは紫外線照射によって誘発される変異に典型的なものである [3,4]。さらに、HaCaT細胞は、p53癌抑制遺伝子の突然変異と、それに続く老化遺伝子の消失によって生成されたと推測されている [5]。
腫瘍抑制遺伝子p53は、DNA修復とゲノムの保護者としての役割で知られ、DNA損傷に対するヒト皮膚の反応を誘導する[4]。HaCaT細胞は、p53遺伝子のin vivo変異によってDNA損傷に対する防御機構を部分的に失っており、培養温度の上昇に反応して細胞遺伝学的変化を蓄積しやすくなっていることが観察されている。HaCaT細胞を不死化するもう一つのメカニズムは、テロメラーゼ酵素活性の上昇である[7]。正常細胞では、細胞老化に達するまで、細胞分裂のたびにテロメアが持続的に短くなる。テロメラーゼは、安定したテロメアの長さを維持する逆転写酵素活性を持つ特殊な細胞酵素複合体である。対照的に、HaCaT細胞はテロメラーゼ活性が著しく上昇し、テロメアの長さが十分に維持されている。これらの観察から、HaCaT細胞の不死化過程におけるテロメラーゼの役割が確認された。
染色体3p、4p、9pの1コピーを失い、9qを獲得し、アイソクロモソームを形成する3つの特異的な染色体転座が同定された。染色体3pの短腕の欠損は、老化遺伝子の欠損とHaCaT細胞の不死化につながる可能性がある[8]。HaCaT細胞は低倍数体であり、単クローン性起源を示す明確で安定したマーカー染色体を有している。HaCaT細胞株の特徴と頭部は、超可変ミニサテライトマーカーを用いたDNAフィンガープリンティングを用いて確認されました[3-6]。
3.5つの簡単なステップでHaCaT細胞を採取する方法
- 培養液を除去し、T25フラスコの場合はカルシウムとマグネシウムを除いたPBSを3～5mL、T75フラスコの場合は5～10mL用いて接着細胞をすすぐ。
- 新しく調製した0.05％EDTA溶液をT25フラスコ1本当たり1～2mL、またはT75フラスコ1本当たり2.5mL加え、細胞シート全体が覆われるようにし、37℃で10分間インキュベートする。
- 新しく調製したトリプシン／EDTA（0.05％／0.025％）溶液を、T25フラスコ当たり1mL、またはT75フラスコ当たり2.5mL加え、再び細胞シートが完全に覆われるようにする。細胞は1-2分以内に剥離するはずである。
- FBSを含む細胞培養培地を加えて、トリプシン活性を止める。
- 新鮮な細胞培養メデュームを入れた新しいフラスコに細胞を分注する。
4.HaCaT細胞の応用
HaCaT細胞は、ケラチノサイトを研究するための貴重な ツールである[9]。これらの不死細胞は前形成細胞として機能し、悪性化および新形成に関与する変化についての洞察を提供することができる[10]。単層HaCaT細胞培養は、細胞毒性およびin vitro創傷治癒分析アプリケーションに不可欠である。HaCaT細胞はまた、様々な薬剤や腫瘍性・炎症性プロセスによる皮膚毒性の評価にも使用できる。HaCaT細胞は、皮膚アレルギー反応のさまざまなメカニズム、活性酸素種の影響、紫外線照射の解析にも利用できる。刺激により、HaCaT細胞は分化し、インボルクリン、K14、K10などの特異的分化マーカーを発現する。HaCaT細胞はまた、表皮恒常性の病態生理学を研究するモデルとしてもよく用いられている[6]。
HaCaT細胞は、移植後もin vivoで構造化された表皮を再構成する能力を保持しており、その結果、培地中のカルシウム濃度を変化させることにより、基底状態と分化状態の間で元に戻すことができる層状表皮構造を形成する。これらの細胞はまた、ビタミンDモデル系としての利用や皮膚における代謝など、いくつかの生物学的プロセスの特徴を明らかにすることも可能である。HaCaT細胞は遺伝子操作されていないため、ヒト皮膚における初期遺伝事象の広範なスペクトルを偏りなく見ることができる。
5.注目のビデオHaCaT細胞の世界を探る
「HaCaT細胞の移動」：このビデオは、HaCaT細胞における細胞移動のプロセスを紹介しています。細胞の移動は、創傷治癒やがん転移など、さまざまな生物学的プロセスにとって不可欠なプロセスです。このビデオでは、顕微鏡下でHaCaT細胞の動きを実演し、細胞がどのように移動するかを視覚的に表現している。細胞がある場所から別の場所に移動する際の活動が観察され、この過程で細胞に起こる変化が動画で分かりやすく説明されている。
「HaCaT細胞で実施したスクラッチアッセイ」：このビデオでは、HaCaT細胞で行われたスクラッチアッセイを紹介しています。スクラッチアッセイは細胞遊走を研究するために広く用いられている手法で、今回はHaCaT細胞の遊走を解析するために用いられています。ビデオでは、細胞培養ディッシュの表面にスクラッチを作り、HaCaT細胞が移動し、時間とともに隙間を埋めていく過程を顕微鏡で観察している。
「創傷治癒実験のためのHaCaTケラチノサイトの細胞増殖」：このビデオは、創傷治癒実験のためのHaCaTケラチノサイトの細胞増殖の過程を示している。HaCaTケラチノサイトは、創傷治癒研究でよく使用される細胞株です。
「HaCaT細胞の分化」：このビデオでは、HaCaT細胞を分化させるために必要な手順を紹介しています。HaCaT細胞は様々なタイプの皮膚細胞に分化することができます。このビデオでは、分化に伴うHaCaT細胞の変化を、様々なマーカーや分化の特徴を視覚的に表現しながら示しています。分化の過程は正常な皮膚機能にとって重要であり、このビデオはHaCaT細胞が受ける分化のさまざまな段階を強調している。
参考文献
- Angel P and Karin M: The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell proliferation and transformation.Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: The regulation of epidermal hyperplastic growth.Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
- Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Isolation and characterization of a spontaneously arising long-lived line of human keratinocytes (NM-1).In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
- Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: ヒト不死化上皮細胞株におけるp53突然変異。癌発生 14:833-839, 1993
- Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Mutation hotspots due to sunlight in the p53 gene of nonmelanoma skin cancer.Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
- Fusenig NE, Boukamp P. ヒト皮膚ケラチノサイトの不死化、悪性化、腫瘍進行における複数の段階と遺伝子変化。 Mol Carcinog.
- Harle-Bachor C, Boukamp P: ヒト皮膚の表皮再生基底層および不死化皮膚ケラチノサイトと癌由来皮膚ケラチノサイトにおけるテロメラーゼ活性。Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
- Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. ヒトケラチノサイトの炎症/修復反応を解剖するための信頼性の高いin vitro分化モデルとしてのHaCaT細胞. Mediators Inflamm.
- Boukamp, P. et al. 自然発生的に不死化した異数性ヒトケラチノサイト細胞株における正常な角化。 J. Cell Biol.Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
- Gibbs, Graham：質的データの分析。The Sage qualitative research kit.London: Sage 978-0-7619-4980-0.
- Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993.Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ.Sage：ロンドン
- Boukamp P.Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N.E. 自然発生的に不死化した異数性ヒト・ケラチノサイト細胞株における正常な角化。 Cell Biol.(1988);106:761-771.