HaCaT-celler

1. Kassera gammalt medium: Ta försiktigt bort det gamla odlingsmediet från kolvarna.
2. Tvätta cellerna: Tillsätt 3-5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan kalcium och magnesium till T25-kolvar, eller 5-10 ml till T75-kolvar, för att skölja de vidhäftande cellerna.
3. Tillsätt EDTA-lösning: Täck cellskiktet helt med en nyberedd 0,05% EDTA-lösning. Använd 1-2 ml för T25-kolvar och 2,5 ml för T75-kolvar.
4. Inkubera: Inkubera kolvarna vid 37°C i 10 minuter.
5. Tillsätt Trypsin/EDTA eller TrypLE Express-lösning: Efter inkubationen, tillsätt en nyberedd trypsin/EDTA-lösning (0,05% trypsin, 0,025% EDTA) eller TrypLE Express till kolvarna och se till att cellagret är helt täckt. Använd 1 ml för T25-kolvar och 2,5 ml för T75-kolvar. (Obs: Steg 3 och 4 kan utelämnas om TrypLE Express används)
6. Övervaka avlägsnandet: Observera cellerna under ett mikroskop. Cellerna ska lossna inom 1-5 minuter.
7. Neutralisera trypsin: Tillsätt cellkulturmedium som innehåller fetalt bovint serum (FBS) för att neutralisera trypsinaktiviteten så snart cellerna har lossnat.
8. Överför cellerna: Fördela cellsuspensionen i nya kolvar som fyllts med färskt odlingsmedium.

1. Bekräfta att flaskan är djupfryst vid leverans, eftersom cellerna skickas på torris för att bibehålla optimala temperaturer under transporten.

2. Vid mottagandet ska du antingen förvara kryovialen omedelbart vid temperaturer under -150 °C för att säkerställa att cellernas integritet bevaras, eller gå vidare till steg 3 om omedelbar odling krävs.

3. Vid omedelbar odling ska injektionsflaskan snabbt tinas genom att den sänks ned i ett 37 °C vattenbad med rent vatten och ett antimikrobiellt medel och omrörs försiktigt i 40-60 sekunder tills en liten isklump återstår.

4. Utför alla efterföljande steg under sterila förhållanden i en flödeshuv och desinficera kryovialerna med 70 % etanol innan de öppnas.

5. Öppna försiktigt den desinficerade flaskan och överför cellsuspensionen till ett 15 ml centrifugrör som innehåller 8 ml rumstempererat odlingsmedium och blanda försiktigt.

6. Centrifugera blandningen vid 300 x g i 3 minuter för att separera cellerna och kassera försiktigt supernatanten som innehåller resterande frysmedium.

7. Resuspendera försiktigt cellpelleten i 10 ml färskt odlingsmedium. För adherenta celler, fördela suspensionen mellan två T25-kulturkolvar; för suspensionskulturer, överför allt medium till en T25-kolv för att främja effektiv cellinteraktion och tillväxt.

8. Följ fastställda subkulturprotokoll för fortsatt tillväxt och underhåll av cellinjen, vilket säkerställer tillförlitliga experimentella resultat.

37°C, 5%_CO2, befuktad atmosfär.

För optimal vidhäftning och viabilitet efter upptining rekommenderar vi att kollagenbelagda kolvar eller plattor används.

Kryopreserverade cellinjer skickas på torris i validerade, isolerade förpackningar med tillräckligt med kylmedel för att hålla cirka -78 °C under hela transporten. Vid mottagandet ska behållaren omedelbart inspekteras och flaskorna utan dröjsmål överföras till lämplig förvaring.

Kryopreserverade cellinjer skickas på torris i validerade, isolerade förpackningar med tillräckligt med kylmedel för att hålla cirka -78 °C under hela transporten. Vid mottagandet ska behållaren omedelbart inspekteras och flaskorna utan dröjsmål överföras till lämplig förvaring.

För långtidsförvaring, placera flaskorna i flytande kväve i ångfas vid ca -150 till -196 °C. Förvaring vid -80 °C är acceptabelt endast som ett kort mellanliggande steg innan överföring till flytande kväve.

Mykoplasmakontaminering utesluts med hjälp av både PCR-baserade analyser och luminiscensbaserade metoder för mykoplasmadiagnostik.

För att säkerställa att det inte finns någon kontaminering av bakterier, svamp eller jäst utsätts cellkulturerna för dagliga visuella inspektioner.