HaCaT細胞

1. 古い培地を捨てる：フラスコから古い培地を注意深く取り除く。
2. 細胞を洗浄する：カルシウムとマグネシウムを除いたリン酸緩衝生理食塩水（PBS）をT25フラスコには3～5ml、T75フラスコには5～10ml加え、接着細胞をすすぐ。
3. EDTA溶液を加える：新しく調製した0.05％EDTA溶液で細胞層全体を覆う。T25フラスコには1-2 ml、T75フラスコには2.5 mlを使用する。
4. インキュベート：フラスコを37℃で10分間インキュベートする。
5. Trypsin/EDTAまたはTrypLE Express溶液を加える：インキュベーション後、新たに調製したトリプシン／EDTA溶液（0.05％トリプシン、0.025％EDTA）またはTrypLE Expressを、細胞層が完全に覆われるようにフラスコに添加する。T25フラスコには1ml、T75フラスコには2.5mlを使用する。(注：TrypLE Expressを使用する場合、ステップ3と4は省略できます。）
6. 剥離を観察する：顕微鏡で細胞を観察する。細胞は1～5分以内に剥離するはずです。
7. トリプシンを中和する：細胞が剥離したらすぐに、ウシ胎児血清（FBS）を含む細胞培養培地を加え、トリプシン活性を中和する。
8. 細胞を移す：細胞懸濁液を、新鮮な培養メデュームをあらかじめ入れた新しいフラスコに分注する。

1. 輸送中の最適温度を維持するため、細胞はドライアイスで輸送される。

2. 凍結バイアルを受け取ったら、細胞の完全性を保つために-150℃以下で直ちに保存するか、直ちに培養が必要な場合はステップ3に進む。

3. 直ちに培養する場合は、バイアルを清浄な水と抗菌剤を入れた37℃のウォーターバスに浸し、小さな氷の塊が残るまで40～60秒間静かに攪拌して速やかに融解する。

4. 凍結バイアルを開封する前に70％エタノールで消毒する。

5. 消毒したバイアルを注意深く開け、細胞懸濁液を8mlの室温培養液を入れた15ml遠心チューブに移し、穏やかに混ぜる。

6. 混合物を300 x gで3分間遠心して細胞を分離し、残留凍結培地を含む上清を注意深く捨てる。

7. 細胞ペレットを10mlの新しい培養液に静かに懸濁する。接着細胞の場合は、懸濁液を2つのT25培養フラスコに分け、懸濁培養の場合は、細胞の相互作用と増殖を効果的に促進するために、全ての培地を1つのT25培養フラスコに移す。

8. 細胞株の継続的な増殖と維持のため、確立された継代培養プロトコールに従 い、信頼できる実験結果を確保する。

37℃、5%_CO2、加湿雰囲気。

解凍後の最適な接着と生存率を得るためには、コラーゲンコートフラスコまたはプレートの使用を推奨する。

凍結保存された細胞株は、輸送中約-78℃を維持するのに十分な保冷剤とともに、有効な断熱包装でドライアイスとともに輸送される。受領後、直ちに容器を検査し、遅滞なくバイアルを適切な保管場所に移してください。

凍結保存された細胞株は、輸送中約-78℃を維持するのに十分な保冷剤とともに、有効な断熱包装でドライアイスとともに輸送される。受領後、直ちに容器を検査し、遅滞なくバイアルを適切な保管場所に移してください。

長期保存の場合、バイアルを-150～-196℃の気相液体窒素に入れる。80℃での保存は、液体窒素に移す前の短い暫定措置としてのみ許容される。

マイコプラズマ汚染は、PCRベースのアッセイと発光ベースのマイコプラズマ検出法の両方を用いて除外される。

細菌、真菌、酵母のコンタミネーションがないことを確認するため、細胞培養物は毎日目視検査を受けている。