خلايا HaCaT

1. تخلص من الوسط القديم: إزالة وسط الزرع القديم بعناية من القوارير.
2. غسل الخلايا: إضافة 3-5 مل من المحلول الملحي المخفوق بالفوسفات (PBS) بدون الكالسيوم والمغنيسيوم إلى قوارير T25، أو 5-10 مل إلى قوارير T75، لشطف الخلايا الملتصقة.
3. أضف محلول EDTA: قم بتغطية طبقة الخلية بالكامل بمحلول EDTA المحضر حديثًا بنسبة 0.05% EDTA. استخدم 1-2 مل لقوارير T25 و2.5 مل لقوارير T75.
4. الاحتضان: احتضن القوارير عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
5. أضف محلول تريبسين/إدتا أو محلول تريبلي السريع: بعد الحضانة، أضف محلول التربسين/إيدتا المحضر حديثًا (0.05% تريبسين 0.05% تريبسين، 0.025% إيدتا) أو محلول تريبلي السريع إلى القوارير مع التأكد من تغطية طبقة الخلايا بالكامل. استخدم 1 مل لقوارير T25 و2.5 مل لقوارير T75. (ملاحظة: يمكن حذف الخطوتين 3 و4 في حالة استخدام TrypLE Express)
6. مراقبة الانفصال: راقب الخلايا تحت المجهر. يجب أن تنفصل الخلايا خلال 1-5 دقائق.
7. تحييد التربسين: أضف وسط مزرعة الخلية الذي يحتوي على مصل بقري جنيني (FBS) لتحييد نشاط التربسين بمجرد انفصال الخلايا.
8. نقل الخلايا: قم بتوزيع معلق الخلية في قوارير جديدة مملوءة مسبقاً بوسط مزرعة جديد.

1. تأكد من بقاء القارورة مجمدة بعمق عند التسليم، حيث يتم شحن الخلايا على ثلج جاف للحفاظ على درجات الحرارة المثلى أثناء النقل.

2. عند الاستلام، إما تخزين القارورة المبردة على الفور في درجة حرارة أقل من -150 درجة مئوية لضمان الحفاظ على سلامة الخلايا، أو الانتقال إلى الخطوة 3 إذا كانت الزراعة الفورية مطلوبة.

3. للاستزراع الفوري، قم بإذابة القارورة بسرعة عن طريق غمرها في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية بماء نظيف وعامل مضاد للميكروبات، مع التحريك برفق لمدة 40-60 ثانية حتى تبقى كتلة ثلج صغيرة.

4. إجراء جميع الخطوات اللاحقة في ظروف معقمة في غطاء تدفق، مع تطهير القارورة المبردة بنسبة 70% من الإيثانول قبل فتحها.

5. افتح القارورة المعقمة بعناية وانقل معلق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 8 مل من وسط المستنبت بدرجة حرارة الغرفة مع الخلط برفق.

6. اطرد الخليط بالطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق لفصل الخلايا وتخلص بعناية من المادة الطافية التي تحتوي على وسط التجميد المتبقي.

7. يُعاد ترسيب كريات الخلية برفق في 10 مل من وسط مزرعة جديد. بالنسبة للخلايا الملتصقة، قم بتقسيم المعلق بين قارورتي مزرعة T25؛ أما بالنسبة لمزارع التعليق، انقل كل الوسط إلى قارورة T25 واحدة لتعزيز تفاعل الخلايا ونموها بشكل فعال.

8. الالتزام ببروتوكولات الاستزراع الفرعي المعمول بها لاستمرار نمو خط الخلية والحفاظ عليه، مما يضمن نتائج تجريبية موثوقة.

37 درجة مئوية، و5% من _ثاني أكسيد الكربون في جو مرطب.

للحصول على التعلق الأمثل والصلاحية المثلى بعد الذوبان، نوصي باستخدام قوارير أو أطباق مغطاة بالكولاجين.

يتم شحن سلالات الخلايا المحفوظة بالتبريد على ثلج جاف في عبوات معزولة وموثوقة مع مبرد كافٍ للحفاظ على درجة حرارة -78 درجة مئوية تقريبًا طوال فترة النقل. عند الاستلام، افحص الحاوية على الفور وانقل القوارير دون تأخير إلى المخزن المناسب.

يتم شحن سلالات الخلايا المحفوظة بالتبريد على ثلج جاف في عبوات معزولة وموثوقة مع مبرد كافٍ للحفاظ على درجة حرارة -78 درجة مئوية تقريبًا طوال فترة النقل. عند الاستلام، افحص الحاوية على الفور وانقل القوارير دون تأخير إلى المخزن المناسب.

للحفظ طويل الأمد، ضع القوارير في نيتروجين سائل في مرحلة البخار عند درجة حرارة تتراوح بين -150 و -196 درجة مئوية تقريباً. يُقبل التخزين عند درجة حرارة -80 درجة مئوية فقط كخطوة مؤقتة قصيرة قبل النقل إلى النيتروجين السائل.

يُستبعد التلوث بالميكوبلازما باستخدام كل من المقايسات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وطرق الكشف عن الميكوبلازما القائمة على الإنارة.

ولضمان عدم وجود تلوث بكتيري أو فطري أو خميرة يتم إخضاع مزارع الخلايا للفحص البصري اليومي.