發佈日期：2023 年 | 最後審閱日期：2026 年 5 月
細胞冷凍綜合指南：確保細胞存活率與無菌性
細胞冷凍是細胞培養管理中的關鍵步驟，能確保珍貴細胞系的長期儲存與保存。無論是處理人類或動物細胞，遵循精確的操作流程並維持嚴格的無菌技術，對於成功進行冷凍保存至關重要。
本指南針對必要材料、試劑及逐步操作流程提供詳細說明，以有效冷凍細胞並同時維持其存活率與無菌狀態。透過遵循這些指引，研究人員能夠自信地儲存細胞培養物，並在日後復甦時將細胞存活率的損失降至最低，從而維持實驗結果的完整性與可靠性。
首先，建立無菌的工作環境至關重要。正確的無菌操作技術在防止污染及確保培養物無菌性方面扮演著關鍵角色。
無菌操作技術
在整個過程中務必遵循無菌操作技術，以確保培養物的無菌狀態。
完整的細胞冷凍流程
此流程圖提供詳細的視覺指南，說明正確冷凍細胞所涉及的關鍵步驟。請遵循這些程序，以確保細胞在冷凍保存過程中保持高存活率與完整性。
冷凍培養基的調製
請根據細胞類型配製冷凍保護劑：
- 含胎牛血清（FBS）的培養基：90% FBS + 10% 二甲基亞砜（DMSO），或 70% 生長培養基、20% FBS 及 10% DMSO
- 需添加甘油的細胞：90% FBS + 10% 甘油
建議選購本公司預調配的冷凍培養基：
- 冷凍培養基 CM-1：適用於需要含胎牛血清（FBS）培養基的實驗方案
- 冷凍培養基 CM-ACF - 無血清型：適用於需要無 FBS 替代方案的情況
細胞製備
針對貼壁細胞：
- 監測細胞直至其匯合度達到 85–95%
- 抽除舊培養基
- 使用不含鈣與鎂的PBS沖洗細胞單層
- 使用 Accutase、胰蛋白酶或胰蛋白酶-EDTA 使細胞脫附，必要時以培養基中和
- 將細胞懸浮液移入 50 mL Falcon 管中
針對懸浮細胞：
- 在顯微鏡下檢查細胞密度與健康狀況
- 將細胞懸浮液直接轉入 50 mL Falcon 離心管中
細胞計數與離心
- 使用血球計數板或自動計數儀進行細胞計數
- 於室溫下以 300g 離心 3-5 分鐘，使細胞沉澱
- 小心地吸除上清液，避免擾動細胞沉澱
- 使用前將調製好的冷凍培養基預熱至 37°C
冷凍保存
- 將細胞沉澱用冷凍培養基重懸，貼壁細胞濃度調至 200 萬個細胞/mL，懸浮細胞濃度調至 500 萬個細胞/mL，或依需求調整至所需濃度
- 將 1.0 毫升（或視需要更多）細胞懸浮液分裝至標有標籤的冷凍管中
- 在將細胞轉移至長期儲存前，請採用緩慢冷凍法
- ？ 方法
- ? 步驟
-
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手動冷凍 -
1️⃣ 將細胞置於冷凍培養基中，放入 4°C 冷凍櫃內冷藏 40 分鐘。
2️⃣ 轉移至 -80°C 冷凍櫃中冷凍 24 小時。
3️⃣ 將細胞儲存在液態氮中以進行長期保存。 -
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使用 Mr. Frosty -
1️⃣ 將細胞與冷凍培養液一同裝入冷凍管中。
2️⃣ 將冷凍管放入 Mr. Frosty 容器內。
3️⃣ 於 -80°C 保存 24 小時後，再轉移至液態氮中。 -
?
控速冷凍機 -
1️⃣ 設定設備以漸進式降低溫度。
2️⃣ 將已準備好的細胞放入冷凍機中。
3️⃣ 冷凍週期結束後，將細胞轉移至液態氮中。
- 為長期保存，請將冷凍管儲存於低於 -130°C 的溫度下，或置於液態氮中。
材料與試劑
- 1–2 mL 冷凍管
- CoolCell® 冷凍裝置或可控速率冷凍櫃
- 冷凍保護凍結培養基（例如：自製冷凍保護劑培養基、CM-1、CM-ACF 或專用培養基）
- 胎牛血清（FBS）或培養上清液
- 二甲基亞砜（DMSO）或甘油
- 不含鈣與鎂的 PBS
- Accutase、胰蛋白酶或胰蛋白酶-EDTA（適用於貼壁細胞）
- 15 mL 或 50 mL Falcon 管
- 血球計數板或自動計數儀
- 離心機