Publicado: 2023 | Última revisão: maio de 2026

Técnicas de dissociação em cultura celular

A dissociação de culturas celulares é uma etapa crítica na manutenção de culturas celulares. Envolve a separação das células de sua superfície de crescimento para permitir a subcultura ou a colheita. Esta seção descreve dois métodos principais: o uso de tampões de dissociação sem enzimas e o uso de reagentes enzimáticos.

Uso de tampões de dissociação celular sem enzimas

Este método é suave e preserva a integridade celular sem o uso de enzimas:

1. Preparação
   • Certifique-se de que todos os reagentes estejam aquecidos a 37 °C antes do uso para evitar choque nas células.
2. Remoção do meio de crescimento:
   • Descarte o meio de crescimento antigo do recipiente de cultura.
3. Enxágue
   • Enxágue as monocamadas celulares com 5 ml de PBS sem cálcio e magnésio por frasco T75 ou placa de 100 mm.
   • Agite suavemente o recipiente por 30 a 60 segundos à temperatura ambiente.
   • Aspirar e descartar a solução de enxágue.
   • Repita essa etapa de enxágue mais uma vez.
4. Dissociação
   • Adicione aproximadamente 5 ml de tampão de dissociação celular sem enzimas ao recipiente.
   • Agite suavemente à temperatura ambiente por 1 a 2 minutos e verifique a dissociação ao microscópio.
   • Bata o frasco ou a placa contra a mão para soltar as células, se necessário.
   • Se as células estiverem aderentes, deixe-as repousar à temperatura ambiente por mais 2 a 5 minutos e bata novamente, se necessário, usando mais tampão de dissociação.
   • Assim que as células estiverem desprendidas, adicione pelo menos 5 ml de meio de crescimento completo para neutralizar o tampão de dissociação e ressuspender as células.
5. Verificação da viabilidade
   • Monitore a viabilidade celular durante a subcultura, garantindo que ela permaneça acima de 90%.

Uso de outros reagentes para dissociação

Este método permite o uso de vários reagentes de dissociação:

1. Remoção do meio usado
   • Descarte o meio antigo do recipiente de cultura.
2. Lavagem das células
   • Lave as células com uma solução salina balanceada, livre de cálcio e magnésio, ou use EDTA.
   • Adicione a solução de lavagem delicadamente pelo lado oposto às células e agite o recipiente por 1 a 2 minutos antes de descartar a solução de lavagem.
3. Dissociação
   • Aplique 2 a 3 ml da solução de dissociação escolhida para cada 25 cm² de superfície de crescimento, garantindo a cobertura da camada celular.
   • Incube o recipiente a 37 °C e agite suavemente. A dissociação geralmente ocorre em 5 a 15 minutos, dependendo da linhagem celular.
   • Para células resistentes, bater levemente no recipiente pode acelerar o processo.
   • Observe as células cuidadosamente para evitar superexposição e possíveis danos.
4. Colheita das células
   • Assim que as células estiverem totalmente desprendidas, deixe-as se acumularem no fundo do recipiente, colocando-o na posição vertical.
   • Adicione meio completo e, em seguida, disperse e recolha as células pipetando sobre a camada celular.
   • Conte as células e prossiga com a subcultura.

Em ambos os métodos, é importante determinar as condições ideais para cada linhagem celular por meio de observação empírica. O processo deve preservar a viabilidade celular, que deve ser verificada rotineiramente para garantir que seja superior a 90% durante a subcultura. Esses procedimentos fornecem uma base para que os pesquisadores os adaptem de acordo com os requisitos e características específicas de suas linhagens celulares.

Visão geral das técnicas para subcultura de células aderentes

A subcultura eficaz de células aderentes requer seu desprendimento do recipiente de cultura. Vários métodos são empregados, cada um adequado para diferentes tipos de células e condições. Ao selecionar um método de dissociação, é crucial considerar as necessidades específicas da linhagem celular e os objetivos do experimento. O monitoramento regular da viabilidade celular, com o objetivo de atingir mais de 90% no momento da subcultura, é essencial para a saúde e a produtividade contínuas da cultura. Aqui está uma visão geral desses procedimentos: