Publicado: 2023 | Última revisão: maio de 2026

Guia Completo para o Congelamento de Células: Garantindo Viabilidade e Esterilidade

O congelamento de células é um processo crítico no gerenciamento de culturas celulares, garantindo o armazenamento e a preservação a longo prazo de valiosas linhagens celulares. Seja trabalhando com células humanas ou animais, seguir protocolos precisos e manter técnicas assépticas rigorosas é fundamental para alcançar uma criopreservação bem-sucedida.

Este guia fornece instruções detalhadas sobre os materiais e reagentes necessários, além de procedimentos passo a passo para congelar células de maneira eficaz, preservando sua viabilidade e esterilidade. Ao seguir essas diretrizes, os pesquisadores podem armazenar e, posteriormente, reativar culturas celulares com confiança, com perda mínima de viabilidade celular, mantendo a integridade e a confiabilidade de seus resultados experimentais.

Para começar, é essencial estabelecer um ambiente de trabalho estéril. Técnicas assépticas adequadas desempenham um papel crucial na prevenção da contaminação e na garantia da esterilidade das culturas.

Técnica Asséptica

Siga as técnicas assépticas durante todo o processo para garantir a esterilidade das culturas.

Processo Abrangente de Congelamento de Células

Este fluxograma fornece um guia visual detalhado das etapas essenciais envolvidas no congelamento adequado de células. Siga esses procedimentos para garantir alta viabilidade e integridade celular durante o processo de criopreservação.

Preparação do meio de congelamento

Prepare o meio de congelamento crioprotetor de acordo com o tipo de célula:

Culturas em meios contendo FBS: 90% de FBS + 10% de DMSO ou 70% de meio de crescimento, 20% de FBS e 10% de DMSO
Células que requerem glicerol: 90% de FBS + 10% de glicerol

Considere adquirir nosso meio de congelamento pré-formulado:

Meio de congelamento CM-1: para protocolos que exigem um meio contendo soro fetal bovino (FBS)
Meio de congelamento CM-ACF – sem soro: para uma alternativa sem FBS

Etiquetagem e documentação

Rotule os criotubos com os seguintes detalhes:

Data
Nome do pesquisador
Número da linha celular
Número de passagem
Tipo de célula
Quaisquer informações adicionais (por exemplo, modificações genéticas)

Preparação celular

Para células aderentes:

Monitore as células até que atinjam 85–95% de confluência
Aspirar o meio de cultura antigo
Enxágue a monocamada celular com PBS sem cálcio e magnésio
Desprenda as células com Accutase, tripsina ou tripsina-EDTA e neutralize com meio de cultura, se necessário
Transfira a suspensão celular para um tubo Falcon de 50 mL

Para células em suspensão:

Verifique a densidade e o estado das células ao microscópio
Transfira a suspensão celular diretamente para um tubo Falcon de 50 mL

Contagem de células e centrifugação

Conte as células usando um hemocitômetro ou contador automático de células
Centrifugue a 300 g por 3 a 5 minutos à temperatura ambiente para sedimentar as células
Aspirar o sobrenadante com cuidado, evitando perturbar o sedimento celular
Aqueça o meio de congelamento preparado a 37 °C antes do uso

Criopreservação

Resuspender o sedimento celular no meio de congelamento até uma densidade de 2,0 milhões de células/mL para células aderentes e 5 milhões de células/mL para células em suspensão, ou na concentração desejada
Divida 1,0 mL (ou mais, conforme necessário) da suspensão celular em criotubos rotulados
Utilize um método de congelamento lento antes de transferir as células para armazenamento de longo prazo

? Método: ? Etapas
❄️ Congelamento manual: 1️⃣ Coloque as células no meio de congelamento em um freezer a 4 °C por 40 minutos.
2️⃣ Transfira para um freezer a -80 °C por 24 horas.
3️⃣ Armazene as células em nitrogênio líquido para preservação de longo prazo.
? Usando o Mr. Frosty: 1️⃣ Prepare as células em criotubos com meio de congelamento.
2️⃣ Coloque os criotubos no recipiente do Mr. Frosty.
3️⃣ Armazene a -80 °C por 24 horas antes de transferir para o nitrogênio líquido.
? Freezer de taxa controlada: 1️⃣ Programe o aparelho para diminuir gradualmente a temperatura.
2️⃣ Coloque as células preparadas no congelador.
3️⃣ Após o ciclo de congelamento, transfira as células para o nitrogênio líquido.

Armazene os criotubos a temperaturas abaixo de -130 °C ou em nitrogênio líquido para preservação de longo prazo.

Materiais e reagentes

Criotubos de 1–2 mL
Unidade de congelamento CoolCell® ou congelador de taxa controlada
Meio de congelamento crioprotetor (por exemplo, meios crioprotetores de fabricação própria, CM-1, CM-ACF ou meios especializados)
Soro fetal bovino (FBS) ou meios condicionados
DMSO ou glicerol
PBS sem cálcio e magnésio
Accutase, tripsina ou tripsina-EDTA (para células aderentes)
Tubos Falcon de 15 mL ou 50 mL
Hemocitômetro ou contador automático de células
Centrífuga