Células HaCaT-ras II-4

1. Descartar o meio antigo: Remova o meio antigo dos frascos.
2. Lavar as células: Adicione 3 a 5 ml de PBS (sem cálcio e magnésio) aos frascos T25, ou 5 a 10 ml aos frascos T75, para lavar as células aderentes.
3. Adicionar solução de EDTA: Cubra completamente a camada celular com uma solução de EDTA a 0,05% recém-preparada — use 1 a 2 ml para frascos T25 e 2,5 ml para frascos T75.
4. Incubação: Incube os frascos a 37 graus Celsius por 10 minutos.
5. Adicione a solução de tripsina/EDTA: Após a incubação, adicione uma solução de tripsina/EDTA recém-preparada (0,05% de tripsina, 0,025% de EDTA) aos frascos, garantindo que as células fiquem totalmente cobertas — use 1 ml para frascos T25 e 2,5 ml para frascos T75.
6. Monitore o desprendimento: Observe as células, que devem se desprender em 1 a 2 minutos.
7. Neutralize a tripsina: Adicione meio de cultura celular contendo FBS para interromper a atividade da tripsina.
8. Transferir as células: Distribua a suspensão celular em novos frascos pré-preenchidos com meio de cultura fresco.

1. Verifique se o frasco permanece profundamente congelado no momento da entrega, pois as células são enviadas em gelo seco para manter as temperaturas ideais durante o transporte.

2. Após o recebimento, armazene o criovial imediatamente a temperaturas abaixo de -150 °C para garantir a preservação da integridade celular ou prossiga para a etapa 3, caso seja necessária a cultura imediata.

3. Para cultura imediata, descongele rapidamente o frasco imergindo-o em um banho-maria a 37 °C com água limpa e um agente antimicrobiano, agitando suavemente por 40 a 60 segundos até que reste apenas um pequeno pedaço de gelo.

4. Realize todas as etapas subsequentes em condições estéreis em uma cabine de fluxo, desinfetando o criovial com etanol a 70% antes de abri-lo.

5. Abra cuidadosamente o frasco desinfetado e transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 8 ml de meio de cultura à temperatura ambiente, misturando delicadamente.

6. Centrifugue a mistura a 300 x g por 3 minutos para separar as células e descarte cuidadosamente o sobrenadante contendo o meio de congelamento residual.

7. Ressuspender suavemente o sedimento celular em 10 ml de meio de cultura fresco. Para células aderentes, dividir a suspensão entre dois frascos de cultura T25; para culturas em suspensão, transferir todo o meio para um frasco T25 a fim de promover a interação e o crescimento celular eficazes.

8. Siga os protocolos de subcultura estabelecidos para o crescimento contínuo e a manutenção da linhagem celular, garantindo resultados experimentais confiáveis.

37 °C, 5% de CO₂, atmosfera umidificada.

As linhagens celulares criopreservadas são enviadas em gelo seco, em embalagens isoladas e validadas, com refrigerante suficiente para manter a temperatura em aproximadamente −78 °C durante todo o transporte. Ao receber a remessa, inspecione o recipiente imediatamente e transfira os frascos sem demora para o local de armazenamento adequado.

Para preservação a longo prazo, coloque os frascos em nitrogênio líquido em fase de vapor a uma temperatura entre aproximadamente −150 e −196 °C. O armazenamento a −80 °C é aceitável apenas como uma etapa intermediária de curta duração antes da transferência para o nitrogênio líquido.

A contaminação por micoplasma é descartada por meio de ensaios baseados em PCR e de métodos de detecção de micoplasma baseados em luminescência.

Para garantir que não haja contaminação por bactérias, fungos ou leveduras, as culturas celulares são submetidas a inspeções visuais diárias.