| Meio de cultura |
Meio Claycomb, 2 mM de glutamina, 10% de FBS, 0,1 mM de norepinefrina em ácido L-ascórbico (Não comercializamos)
Prepare 0,1 mM de norepinefrina em ácido L-ascórbico:
Prepare uma solução-mãe 100 vezes mais concentrada = 10 mM de norepinefrina.
1. Prepare uma solução de ácido L-ascórbico a 30 mM (50 mL)
2. Adicione 160 mg de norepinefrina à solução de ácido ascórbico (50 mL) = 10 mM de norepinefrina
3. Filtre a solução de forma estéril por meio de um cartucho de filtro de 0,2 µm.
4. Encha frascos estéreis com alíquotas de 1 mL da solução-mãe de norepinefrina 100 vezes concentrada e armazene a −20 °C. Envolva em papel-alumínio; deve ser protegida da luz. A solução é estável por aproximadamente 1 mês a −20 °C.
5. Adicione 1 mL dessa solução a 100 mL de meio Claycomb. O meio permanece estável por apenas 1 mês. |
| Suplementos |
Adicione ao meio 10% de FBS, 2 mM de glutamina e 0,1 mM de norepinefrina em ácido L-ascórbico |
| Reagente de dissociação |
Accutase |
| Tempo de duplicação |
aproximadamente 24 a 36 horas |
| Subcultura |
Remova o meio antigo das células aderentes e lave-as com PBS sem cálcio nem magnésio. Para frascos T25, use 3 a 5 ml de PBS; para frascos T75, use 5 a 10 ml. Em seguida, cubra as células completamente com Accutase, utilizando 1 a 2 ml para frascos T25 e 2,5 ml para frascos T75. Deixe as células incubarem à temperatura ambiente por 8 a 10 minutos para que se desprendam. Após a incubação, misture delicadamente as células com 10 ml de meio para ressuspender, depois centrifugue a 300xg por 3 minutos. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em meio fresco e transfira-as para novos frascos que já contenham meio fresco. |
| Proporção de divisão |
1 a 3 |
| Densidade de semeadura |
2 a 4 x 10⁴ células/cm² |
| Renovação de fluidos |
Diariamente (o meio Claycomb é trocado a cada 24 horas para manter o fenótipo contrátil) |
| Recuperação pós-degelo |
Após o descongelamento, semeie as células em frascos revestidos com fibronectina/gelatina (faça o pré-revestimento com 12,5 µg/ml de fibronectina e 0,02% de gelatina; incube a 37 °C por ≥1 hora; aspire o conteúdo antes da semeadura). Aguarde 24–48 horas para a adesão e recuperação antes da primeira troca de meio. A partir de então, alimente diariamente com meio Claycomb suplementado. |
| Meio de congelamento |
Como meio de criopreservação, utilizamos meio de crescimento completo (incluindo FBS) + 10% de DMSO para garantir viabilidade adequada após o descongelamento, ou CM-1 (número de catálogo da Cytion 800100), que inclui osmoprotetores e estabilizadores metabólicos otimizados para melhorar a recuperação e reduzir o estresse induzido pela criopreservação. |
| Descongelamento e cultura de células |
Verifique se o frasco permanece profundamente congelado no momento da entrega, pois as células são enviadas em gelo seco para manter as temperaturas ideais durante o transporte.
Após o recebimento, armazene o criovial imediatamente a temperaturas abaixo de -150 °C para garantir a preservação da integridade celular ou prossiga para a etapa 3, caso seja necessária a cultura imediata.
Para cultura imediata, descongele rapidamente o frasco imergindo-o em um banho-maria a 37 °C com água limpa e um agente antimicrobiano, agitando suavemente por 40 a 60 segundos até que reste apenas um pequeno pedaço de gelo.
Realize todas as etapas subsequentes em condições estéreis em uma cabine de fluxo, desinfetando o criovial com etanol a 70% antes de abri-lo.
Abra cuidadosamente o frasco desinfetado e transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 8 ml de meio de cultura à temperatura ambiente, misturando delicadamente.
Centrifugue a mistura a 300 x g por 3 minutos para separar as células e descarte cuidadosamente o sobrenadante contendo o meio de congelamento residual.
Ressuspender suavemente o sedimento celular em 10 ml de meio de cultura fresco. Para células aderentes, dividir a suspensão entre dois frascos de cultura T25; para culturas em suspensão, transferir todo o meio para um frasco T25 a fim de promover a interação e o crescimento celular eficazes.
Siga os protocolos de subcultura estabelecidos para o crescimento contínuo e a manutenção da linhagem celular, garantindo resultados experimentais confiáveis.
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| Atmosfera de incubação |
37 °C, 5% de CO₂, atmosfera umidificada. |
| Revestimento de frascos |
Os frascos de cultura celular devem ser revestidos com fibronectina e gelatina. Colocam-se 25 µg de fibronectina, dissolvidos em 2 ml de gelatina a 0,02% em água, em um frasco T25 e incubam-se durante a noite a 37 °C |
| Condições de envio |
As linhagens celulares criopreservadas são enviadas em gelo seco, em embalagens isoladas e validadas, com refrigerante suficiente para manter a temperatura em aproximadamente −78 °C durante todo o transporte. Ao receber a remessa, inspecione o recipiente imediatamente e transfira os frascos sem demora para o local de armazenamento adequado. |
| Condições de armazenamento |
Para preservação a longo prazo, coloque os frascos em nitrogênio líquido em fase de vapor a uma temperatura entre aproximadamente −150 e −196 °C. O armazenamento a −80 °C é aceitável apenas como uma etapa intermediária de curta duração antes da transferência para o nitrogênio líquido. |
