| Milieu de culture |
RPMI 1640, contenant 2,1 mM de glutamine stable et 2,0 g/L de NaHCO₃ (numéro d'article Cytion 820700a) |
| Suppléments |
Ajouter 10 % de FBS au milieu de culture |
| Réactif de dissociation |
Le mélange 1:1 d’EDTA (solution mère à 0,05 %) et de trypsine (solution mère à 0,1 %) doit être préparé à chaque fois avant de détacher les cellules à l’aide de PBS sans Ca²⁺ ni Mg²⁺ afin d’obtenir une osmolarité physiologique. Les mélanges prêts à l’emploi de trypsine/EDTA ne sont pas recommandés, car ils peuvent entraîner la formation d’agrégats cellulaires. À titre d’alternative, on peut utiliser TrypLE Express (Life Technologies) à la place de la trypsine/EDTA. Il convient de suivre le protocole du fabricant. |
| Repiquage |
Retirez l’ancien milieu des cellules adhérentes et lavez-les avec du PBS sans calcium ni magnésium. Pour les flacons T25, utilisez 3 à 5 ml de PBS, et pour les flacons T75, utilisez 5 à 10 ml. Ensuite, recouvrez complètement les cellules d’Accutase, en utilisant 1 à 2 ml pour les flacons T25 et 2,5 ml pour les flacons T75. Laissez les cellules incuber à température ambiante pendant 8 à 10 minutes afin de les détacher. Après l’incubation, mélangez délicatement les cellules avec 10 ml de milieu pour les remettre en suspension, puis centrifugez à 300 x g pendant 3 minutes. Éliminez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans du milieu frais, puis transférez-les dans de nouveaux flacons contenant déjà du milieu frais. |
| Densité de semis |
2 à 4 × 10⁴/cm² |
| Renouvellement des fluides |
1 à 2 fois par semaine |
| Milieu de congélation |
Comme milieu de cryoconservation, nous utilisons un milieu de croissance complet (contenant du sérum fœtal bovin) + 10 % de DMSO pour assurer une viabilité adéquate après décongélation, ou du CM-1 (référence Cytion 800100), qui contient des osmoprotecteurs et des stabilisateurs métaboliques optimisés pour améliorer la récupération et réduire le stress induit par la cryoconservation. |
| Décongélation et culture des cellules |
Assurez-vous que le flacon reste bien congelé à la livraison, car les cellules sont expédiées sur de la glace sèche afin de maintenir des températures optimales pendant le transport.
À la réception, conservez immédiatement le cryofiole à une température inférieure à -150 °C pour garantir la préservation de l’intégrité cellulaire, ou passez à l’étape 3 si une culture immédiate est nécessaire.
Pour une culture immédiate, décongelez rapidement le flacon en l’immergeant dans un bain-marie à 37 °C contenant de l’eau propre et un agent antimicrobien, en agitant doucement pendant 40 à 60 secondes jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un petit morceau de glace.
Effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire, en désinfectant le cryotube avec de l’éthanol à 70 % avant de l’ouvrir.
Ouvrez avec précaution le flacon désinfecté et transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 8 ml de milieu de culture à température ambiante, en mélangeant délicatement.
Centrifuger le mélange à 300 x g pendant 3 minutes pour séparer les cellules, puis jeter avec précaution le surnageant contenant le milieu de congélation résiduel.
Remettre délicatement le culot cellulaire en suspension dans 10 ml de milieu de culture frais. Pour les cellules adhérentes, répartir la suspension dans deux flacons de culture T25; pour les cultures en suspension, transférer la totalité du milieu dans un seul flacon T25 afin de favoriser une interaction et une croissance cellulaires efficaces.
Respectez les protocoles de sous-culture établis pour assurer la croissance continue et le maintien de la lignée cellulaire, garantissant ainsi des résultats expérimentaux fiables.
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| Atmosphère d'incubation |
37 °C, 5 % de CO₂, atmosphère humidifiée. |
| Conditions d'expédition |
Les lignées cellulaires cryoconservées sont expédiées dans de la glace sèche, dans un emballage isotherme validé contenant suffisamment de réfrigérant pour maintenir une température d’environ −78 °C pendant tout le transport. À la réception, inspectez immédiatement le conteneur et transférez sans délai les flacons dans un lieu de stockage approprié. |
| Conditions d'entreposage |
Pour une conservation à long terme, placez les flacons dans de l’azote liquide en phase vapeur à une température comprise entre environ −150 et −196 °C. L’entreposage à −80 °C n’est acceptable qu’à titre d’étape intermédiaire de courte durée avant le transfert dans l’azote liquide. |
