| Milieu de culture |
DMEM : F12 de Ham (1:1), p/v : 3,1 g/L de glucose, p/v : 2,5 mM de L-glutamine, p/v : 15 mM d’HEPES, 0,5 mM de pyruvate de sodium, 1,2 g/L de NaHCO₃ (référence Cytion 820400a) |
| Suppléments |
Ajouter au milieu 5 mg/L d’héparine, 20 ng/mL de bFGF, 20 microgrammes/L d’EGF, 5 mg/L d’insuline, 100 mg/L de transferrine, 5,2 microgrammes/L de sélénite de sodium, 6,3 microgrammes/L de progestérone, 161,1 microgrammes/L de putrescine et 50 mg/L d’hydrocortisone |
| Repiquage |
Pour la repiquage de cultures de sphéroïdes, commencez par dissocier mécaniquement les sphéroïdes en effectuant 5 à 10 mouvements de pipetage de haut en bas à l’aide d’une pipette Eppendorf munie d’embouts filtrants de 1 000 μl. Ensuite, centrifugez le mélange à 300 g pendant 5 minutes à température ambiante pour obtenir un culot cellulaire. Éliminez le surnageant et remettez le culot cellulaire en suspension dans un milieu de culture frais. Enfin, transférez les cellules remises en suspension dans de nouveaux récipients de culture afin de favoriser la poursuite de la formation de sphéroïdes. Cette approche garantit une désagrégation efficace des sphéroïdes et les prépare à poursuivre leur croissance dans un nouvel environnement.
|
| Densité de semis |
1 × 10⁵ cellules/mL |
| Renouvellement des fluides |
2 à 3 fois par semaine |
| Rétablissement après le dégel |
Après la décongélation, laissez les cellules se remettre du processus de congélation pendant au moins 24 à 48 heures. |
| Milieu de congélation |
Comme milieu de cryoconservation, nous utilisons un mélange composé de 50 % de milieu de base + 40 % de FBS + 10 % de DMSO, ou du CM-1 (numéro de catalogue Cytion 800100), qui contient des osmoprotecteurs et des stabilisateurs métaboliques optimisés afin d’améliorer la récupération et de réduire le stress induit par la cryoconservation. |
| Décongélation et culture des cellules |
Assurez-vous que le flacon reste bien congelé à la livraison, car les cellules sont expédiées sur de la glace sèche afin de maintenir des températures optimales pendant le transport.
À la réception, conservez immédiatement le cryofiole à une température inférieure à -150 °C pour garantir la préservation de l’intégrité cellulaire, ou passez à l’étape 3 si une culture immédiate est nécessaire.
Pour une culture immédiate, décongelez rapidement le flacon en l’immergeant dans un bain-marie à 37 °C contenant de l’eau propre et un agent antimicrobien, en agitant doucement pendant 40 à 60 secondes jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un petit morceau de glace.
Effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire, en désinfectant le cryotube avec de l’éthanol à 70 % avant de l’ouvrir.
Ouvrez avec précaution le flacon désinfecté et transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 8 ml de milieu de culture à température ambiante, en mélangeant délicatement.
Centrifuger le mélange à 300 x g pendant 3 minutes pour séparer les cellules, puis jeter avec précaution le surnageant contenant le milieu de congélation résiduel.
Remettre délicatement le culot cellulaire en suspension dans 10 ml de milieu de culture frais. Pour les cellules adhérentes, répartir la suspension dans deux flacons de culture T25; pour les cultures en suspension, transférer la totalité du milieu dans un seul flacon T25 afin de favoriser une interaction et une croissance cellulaires efficaces.
Respectez les protocoles de sous-culture établis pour assurer la croissance continue et le maintien de la lignée cellulaire, garantissant ainsi des résultats expérimentaux fiables.
|
| Atmosphère d'incubation |
37 °C, 5 % de CO₂, atmosphère humidifiée. |
| Conditions d'expédition |
Les lignées cellulaires cryoconservées sont expédiées dans de la glace sèche, dans un emballage isotherme validé contenant suffisamment de réfrigérant pour maintenir une température d’environ −78 °C pendant tout le transport. À la réception, inspectez immédiatement le conteneur et transférez sans délai les flacons dans un lieu de stockage approprié. |
| Conditions d'entreposage |
Pour une conservation à long terme, placez les flacons dans de l’azote liquide en phase vapeur à une température comprise entre environ −150 et −196 °C. L’entreposage à −80 °C n’est acceptable qu’à titre d’étape intermédiaire de courte durée avant le transfert dans l’azote liquide. |
