Cellules HaCaT-ras II-4

1. Éliminer l'ancien milieu : Retirer l'ancien milieu des flacons.
2. Laver les cellules : Ajouter 3 à 5 ml de PBS (sans calcium ni magnésium) dans les flacons T25, ou 5 à 10 ml dans les flacons T75, pour laver les cellules adhérentes.
3. Ajouter la solution d’EDTA : Recouvrir complètement la couche cellulaire d’une solution d’EDTA à 0,05 % fraîchement préparée — utiliser 1 à 2 ml pour les flacons T25 et 2,5 ml pour les flacons T75.
4. Incubation : Incuber les flacons à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.
5. Ajouter la solution de trypsine/EDTA : Après l’incubation, ajoutez une solution de trypsine/EDTA fraîchement préparée (0,05 % de trypsine, 0,025 % d’EDTA) dans les flacons, en veillant à ce que les cellules soient entièrement recouvertes — utilisez 1 ml pour les flacons T25 et 2,5 ml pour les flacons T75.
6. Surveiller le détachement : Observer les cellules, qui devraient se détacher en 1 à 2 minutes.
7. Neutraliser la trypsine : Ajouter du milieu de culture cellulaire contenant du FBS pour arrêter l’activité de la trypsine.
8. Transférer les cellules : Verser la suspension cellulaire dans de nouveaux flacons préremplis de milieu de culture frais.

1. Assurez-vous que le flacon reste bien congelé à la livraison, car les cellules sont expédiées sur de la glace sèche afin de maintenir des températures optimales pendant le transport.

2. À la réception, conservez immédiatement le cryofiole à une température inférieure à -150 °C pour garantir la préservation de l’intégrité cellulaire, ou passez à l’étape 3 si une culture immédiate est nécessaire.

3. Pour une culture immédiate, décongelez rapidement le flacon en l’immergeant dans un bain-marie à 37 °C contenant de l’eau propre et un agent antimicrobien, en agitant doucement pendant 40 à 60 secondes jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un petit morceau de glace.

4. Effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire, en désinfectant le cryotube avec de l’éthanol à 70 % avant de l’ouvrir.

5. Ouvrez avec précaution le flacon désinfecté et transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 8 ml de milieu de culture à température ambiante, en mélangeant délicatement.

6. Centrifuger le mélange à 300 x g pendant 3 minutes pour séparer les cellules, puis jeter avec précaution le surnageant contenant le milieu de congélation résiduel.

7. Remettre délicatement le culot cellulaire en suspension dans 10 ml de milieu de culture frais. Pour les cellules adhérentes, répartir la suspension dans deux flacons de culture T25; pour les cultures en suspension, transférer la totalité du milieu dans un seul flacon T25 afin de favoriser une interaction et une croissance cellulaires efficaces.

8. Respectez les protocoles de sous-culture établis pour assurer la croissance continue et le maintien de la lignée cellulaire, garantissant ainsi des résultats expérimentaux fiables.

37 °C, 5 % _de CO_₂, atmosphère humidifiée.

Les lignées cellulaires cryoconservées sont expédiées dans de la glace sèche, dans un emballage isotherme validé contenant suffisamment de réfrigérant pour maintenir une température d’environ −78 °C pendant tout le transport. À la réception, inspectez immédiatement le conteneur et transférez sans délai les flacons dans un lieu de stockage approprié.

Pour une conservation à long terme, placez les flacons dans de l’azote liquide en phase vapeur à une température comprise entre environ −150 et −196 °C. L’entreposage à −80 °C n’est acceptable qu’à titre d’étape intermédiaire de courte durée avant le transfert dans l’azote liquide.

La contamination par les mycoplasmes est exclue à l'aide de tests basés sur la PCR et de méthodes de détection des mycoplasmes par luminescence.

Afin de s’assurer qu’il n’y a aucune contamination bactérienne, fongique ou par des levures, les cultures cellulaires font l’objet d’inspections visuelles quotidiennes.