| Milieu de culture |
Milieu Claycomb, 2 mM de glutamine, 10 % de FBS, 0,1 mM de norépinéphrine dans de l’acide L-ascorbique (produit non disponible à la vente)
Préparez une solution de 0,1 mM de norépinéphrine dans de l’acide L-ascorbique :
Préparez une solution mère 100 fois plus concentrée = 10 mM de norépinéphrine.
1. Préparez une solution d’acide L-ascorbique à 30 mM (50 mL)
2. Ajouter 160 mg de norépinéphrine à la solution d’acide L-ascorbique (50 mL) = 10 mM de norépinéphrine
3. Filtrer la solution de manière stérile à l’aide d’une cartouche filtrante de 0,2 µm.
4. Verser des aliquotes de 1 mL de la solution mère de norépinéphrine 100 fois concentrée dans des flacons stériles et les entreposer à −20 °C. Envelopper dans du papier d’aluminium; la solution doit être protégée de la lumière. La solution est stable pendant environ 1 mois à −20 °C.
5. Ajouter 1 mL de cette solution à 100 mL de milieu Claycomb. Le milieu n’est stable que pendant 1 mois. |
| Suppléments |
Ajouter au milieu 10 % de FBS, 2 mM de glutamine et 0,1 mM de norépinéphrine dans de l'acide L-ascorbique |
| Réactif de dissociation |
Accutase |
| Temps de doublement |
environ 24 à 36 heures |
| Repiquage |
Retirez l’ancien milieu des cellules adhérentes et lavez-les avec du PBS sans calcium ni magnésium. Pour les flacons T25, utilisez 3 à 5 ml de PBS, et pour les flacons T75, utilisez 5 à 10 ml. Ensuite, recouvrez complètement les cellules d’Accutase, en utilisant 1 à 2 ml pour les flacons T25 et 2,5 ml pour les flacons T75. Laissez les cellules incuber à température ambiante pendant 8 à 10 minutes afin de les détacher. Après l’incubation, mélangez délicatement les cellules avec 10 ml de milieu pour les remettre en suspension, puis centrifugez à 300 x g pendant 3 minutes. Éliminez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans du milieu frais, puis transférez-les dans de nouveaux flacons contenant déjà du milieu frais. |
| Rapport de fractionnement |
1 à 3 |
| Densité de semis |
de 2 à 4 × 10⁴ cellules/cm² |
| Renouvellement des fluides |
Quotidiennement (milieu Claycomb renouvelé toutes les 24 heures afin de maintenir le phénotype contractile) |
| Rétablissement après le dégel |
Après décongélation, ensemencer les cellules dans des flacons recouverts de fibronectine et de gélatine (précouvrir avec 12,5 µg/ml de fibronectine et 0,02 % de gélatine; incuber à 37 °C pendant au moins 1 heure, aspirer avant l’ensemencement). Laisser 24 à 48 heures pour l’adhérence et la récupération avant le premier changement de milieu. Par la suite, alimenter quotidiennement avec du milieu Claycomb enrichi. |
| Milieu de congélation |
Comme milieu de cryoconservation, nous utilisons un milieu de croissance complet (contenant du sérum fœtal bovin) + 10 % de DMSO pour assurer une viabilité adéquate après décongélation, ou du CM-1 (référence Cytion 800100), qui contient des osmoprotecteurs et des stabilisateurs métaboliques optimisés pour améliorer la récupération et réduire le stress induit par la cryoconservation. |
| Décongélation et culture des cellules |
Assurez-vous que le flacon reste bien congelé à la livraison, car les cellules sont expédiées sur de la glace sèche afin de maintenir des températures optimales pendant le transport.
À la réception, conservez immédiatement le cryofiole à une température inférieure à -150 °C pour garantir la préservation de l’intégrité cellulaire, ou passez à l’étape 3 si une culture immédiate est nécessaire.
Pour une culture immédiate, décongelez rapidement le flacon en l’immergeant dans un bain-marie à 37 °C contenant de l’eau propre et un agent antimicrobien, en agitant doucement pendant 40 à 60 secondes jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un petit morceau de glace.
Effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire, en désinfectant le cryotube avec de l’éthanol à 70 % avant de l’ouvrir.
Ouvrez avec précaution le flacon désinfecté et transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 8 ml de milieu de culture à température ambiante, en mélangeant délicatement.
Centrifuger le mélange à 300 x g pendant 3 minutes pour séparer les cellules, puis jeter avec précaution le surnageant contenant le milieu de congélation résiduel.
Remettre délicatement le culot cellulaire en suspension dans 10 ml de milieu de culture frais. Pour les cellules adhérentes, répartir la suspension dans deux flacons de culture T25; pour les cultures en suspension, transférer la totalité du milieu dans un seul flacon T25 afin de favoriser une interaction et une croissance cellulaires efficaces.
Respectez les protocoles de sous-culture établis pour assurer la croissance continue et le maintien de la lignée cellulaire, garantissant ainsi des résultats expérimentaux fiables.
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| Atmosphère d'incubation |
37 °C, 5 % de CO₂, atmosphère humidifiée. |
| Revêtement des flacons |
Les flacons de culture cellulaire doivent être enduits de fibronectine et de gélatine. On verse 25 µg de fibronectine, dissous dans 2 ml d’une solution aqueuse de gélatine à 0,02 %, dans un flacon T25, puis on incube le tout pendant une nuit à 37 °C. |
| Conditions d'expédition |
Les lignées cellulaires cryoconservées sont expédiées dans de la glace sèche, dans un emballage isotherme validé contenant suffisamment de réfrigérant pour maintenir une température d’environ −78 °C pendant tout le transport. À la réception, inspectez immédiatement le conteneur et transférez sans délai les flacons dans un lieu de stockage approprié. |
| Conditions d'entreposage |
Pour une conservation à long terme, placez les flacons dans de l’azote liquide en phase vapeur à une température comprise entre environ −150 et −196 °C. L’entreposage à −80 °C n’est acceptable qu’à titre d’étape intermédiaire de courte durée avant le transfert dans l’azote liquide. |
