Células HaCaT-ras II-4

1. Deshacerse del medio usado: Retirar el medio usado de los frascos.
2. Lavar las células: Agrega 3-5 ml de PBS (sin calcio ni magnesio) a los frascos T25, o 5-10 ml a los frascos T75, para lavar las células adherentes.
3. Agregar solución de EDTA: Cubra completamente la capa celular con una solución de EDTA al 0,05 % recién preparada; utilice de 1 a 2 ml para los frascos T25 y 2,5 ml para los frascos T75.
4. Incubación: Incube los frascos a 37 grados Celsius durante 10 minutos.
5. Agregar la solución de tripsina/EDTA: Tras la incubación, agregue una solución de tripsina/EDTA recién preparada (0,05 % de tripsina, 0,025 % de EDTA) a los frascos, asegurándose de que las células queden completamente cubiertas; utilice 1 ml para los frascos T25 y 2,5 ml para los frascos T75.
6. Supervisar el desprendimiento: Observe las células, que deberían desprenderse en un plazo de 1 a 2 minutos.
7. Neutralizar la tripsina: Agregue medio de cultivo celular que contenga FBS para detener la actividad de la tripsina.
8. Transferir las células: Verter la suspensión celular en frascos nuevos previamente llenados con medio de cultivo fresco.

1. Verifique que el vial se mantenga profundamente congelado al momento de la entrega, ya que las células se envían en hielo seco para mantener temperaturas óptimas durante el transporte.

2. Al recibirlo, almacene el criovial inmediatamente a temperaturas inferiores a -150 °C para garantizar la preservación de la integridad celular, o bien continúe con el paso 3 si se requiere un cultivo inmediato.

3. Para el cultivo inmediato, descongele rápidamente el vial sumergiéndolo en un baño de agua a 37 °C con agua limpia y un agente antimicrobiano, agitando suavemente durante 40 a 60 segundos hasta que quede un pequeño trozo de hielo.

4. Realice todos los pasos posteriores en condiciones estériles bajo una cabina de flujo laminar, desinfectando el criovial con etanol al 70 % antes de abrirlo.

5. Abra con cuidado el vial desinfectado y transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 8 ml de medio de cultivo a temperatura ambiente, mezclando suavemente.

6. Centrifugue la mezcla a 300 x g durante 3 minutos para separar las células y deseche con cuidado el sobrenadante que contenga medio de congelación residual.

7. Resuspende suavemente el sedimento celular en 10 ml de medio de cultivo fresco. Para las células adherentes, divide la suspensión entre dos frascos de cultivo T25; para los cultivos en suspensión, transfiere todo el medio a un solo frasco T25 para promover una interacción y un crecimiento celular efectivos.

8. Siga los protocolos de subcultivo establecidos para el crecimiento y mantenimiento continuos de la línea celular, asegurando resultados experimentales confiables.

37 °C, 5 % de CO₂, atmósfera humidificada.

Las líneas celulares criopreservadas se envían en hielo seco, en un embalaje aislante validado que contiene suficiente refrigerante para mantener una temperatura de aproximadamente −78 °C durante todo el transporte. Al recibir el envío, revise el contenedor de inmediato y traslade los viales sin demora al lugar de almacenamiento adecuado.

Para la conservación a largo plazo, coloque los viales en nitrógeno líquido en fase de vapor a una temperatura de entre −150 y −196 °C, aproximadamente. El almacenamiento a −80 °C solo es aceptable como un paso intermedio breve antes de transferirlos al nitrógeno líquido.

Se descarta la contaminación por micoplasmas mediante ensayos basados en PCR y métodos de detección de micoplasmas basados en luminiscencia.

Para garantizar que no haya contaminación bacteriana, fúngica o por levaduras, los cultivos celulares se someten a inspecciones visuales diarias.