| Medio de cultivo |
Medio Claycomb, 2 mM de glutamina, 10 % de FBS, 0,1 mM de norepinefrina en ácido L-ascórbico (No lo vendemos)
Prepare 0,1 mM de norepinefrina en ácido L-ascórbico:
Prepare una solución madre 100 veces más concentrada = 10 mM de norepinefrina.
1. Prepara una solución de ácido L-ascórbico a 30 mM (50 mL)
2. Agrega 160 mg de norepinefrina a la solución de ácido L-ascórbico (50 mL) = 10 mM de norepinefrina
3. Filtra la solución de manera estéril mediante un cartucho filtrante de 0,2 µm.
4. Vierta alícuotas de 1 mL de la solución madre de norepinefrina 100 veces más concentrada en viales estériles y guárdelos a −20 °C. Envuélvalos en papel de aluminio; deben protegerse de la luz. La solución es estable durante aproximadamente 1 mes a −20 °C.
5. Agregue 1 mL de esta solución a 100 mL de medio Claycomb. El medio es estable solo durante 1 mes. |
| Suplementos |
Añada al medio un 10 % de FBS, 2 mM de glutamina y 0,1 mM de norepinefrina en ácido L-ascórbico |
| Reactivo de disociación |
Accutase |
| Tiempo de duplicación |
aprox. de 24 a 36 horas |
| Subcultivo |
Retira el medio usado de las células adheridas y lávalas con PBS sin calcio ni magnesio. Para los frascos T25, usa de 3 a 5 ml de PBS, y para los frascos T75, usa de 5 a 10 ml. Luego, cubra las células por completo con Accutase, utilizando de 1 a 2 ml para los frascos T25 y 2,5 ml para los frascos T75. Deje que las células se incuben a temperatura ambiente durante 8 a 10 minutos para desprenderse. Después de la incubación, mezcla suavemente las células con 10 ml de medio para resuspendarlas; luego, centrifuga a 300xg durante 3 minutos. Deseche el sobrenadante, resuspenda las células en medio fresco y transfiéralas a frascos nuevos que ya contengan medio fresco. |
| Relación de división |
1 a 3 |
| Densidad de siembra |
De 2 a 4 × 10⁴ células/cm² |
| Renovación de fluidos |
Diario (el medio Claycomb se cambia cada 24 horas para mantener el fenotipo contráctil) |
| Recuperación tras el deshielo |
Después de descongelar, siembre las células en frascos recubiertos con fibronectina y gelatina (recubra previamente con 12,5 µg/ml de fibronectina y 0,02 % de gelatina; incube a 37 °C durante al menos 1 hora y aspire el contenido antes de la siembra). Deje que las células se adhieran y se recuperen durante 24 a 48 horas antes del primer cambio de medio. A partir de entonces, alimente las células diariamente con medio Claycomb suplementado. |
| Medio de congelación |
Como medio de criopreservación, utilizamos un medio de crecimiento completo (que incluye FBS) + 10 % de DMSO para garantizar una viabilidad adecuada tras la descongelación, o CM-1 (número de catálogo de Cytion 800100), que incluye osmoprotectores y estabilizadores metabólicos optimizados para mejorar la recuperación y reducir el estrés inducido por la criopreservación. |
| Descongelación y cultivo de células |
Verifique que el vial se mantenga profundamente congelado al momento de la entrega, ya que las células se envían en hielo seco para mantener temperaturas óptimas durante el transporte.
Al recibirlo, almacene el criovial inmediatamente a temperaturas inferiores a -150 °C para garantizar la preservación de la integridad celular, o bien continúe con el paso 3 si se requiere un cultivo inmediato.
Para el cultivo inmediato, descongele rápidamente el vial sumergiéndolo en un baño de agua a 37 °C con agua limpia y un agente antimicrobiano, agitando suavemente durante 40 a 60 segundos hasta que quede un pequeño trozo de hielo.
Realice todos los pasos posteriores en condiciones estériles bajo una cabina de flujo laminar, desinfectando el criovial con etanol al 70 % antes de abrirlo.
Abra con cuidado el vial desinfectado y transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 8 ml de medio de cultivo a temperatura ambiente, mezclando suavemente.
Centrifugue la mezcla a 300 x g durante 3 minutos para separar las células y deseche con cuidado el sobrenadante que contenga medio de congelación residual.
Resuspende suavemente el sedimento celular en 10 ml de medio de cultivo fresco. Para las células adherentes, divide la suspensión entre dos frascos de cultivo T25; para los cultivos en suspensión, transfiere todo el medio a un solo frasco T25 para promover una interacción y un crecimiento celular efectivos.
Siga los protocolos de subcultivo establecidos para el crecimiento y mantenimiento continuos de la línea celular, asegurando resultados experimentales confiables.
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| Atmósfera de incubación |
37 °C, 5 % de CO₂, atmósfera humidificada. |
| Recubrimiento de frascos |
Los frascos de cultivo celular deben recubrirse con fibronectina y gelatina. Se colocan 25 µg de fibronectina, disueltos en 2 ml de gelatina al 0,02 % en agua, en un frasco T25 y se incuban durante toda la noche a 37 °C. |
| Condiciones de envío |
Las líneas celulares criopreservadas se envían en hielo seco, en un embalaje aislante validado que contiene suficiente refrigerante para mantener una temperatura de aproximadamente −78 °C durante todo el transporte. Al recibir el envío, revise el contenedor de inmediato y traslade los viales sin demora al lugar de almacenamiento adecuado. |
| Condiciones de almacenamiento |
Para la conservación a largo plazo, coloque los viales en nitrógeno líquido en fase de vapor a una temperatura de entre −150 y −196 °C, aproximadamente. El almacenamiento a −80 °C solo es aceptable como un paso intermedio breve antes de transferirlos al nitrógeno líquido. |
