Publicado: 2023 | Última revisión: mayo de 2026
Guía completa para la congelación de células: cómo garantizar la viabilidad y la esterilidad
La congelación de células es un proceso fundamental en el manejo de cultivos celulares, ya que garantiza el almacenamiento y la conservación a largo plazo de valiosas líneas celulares. Ya sea que se trabaje con células humanas o animales, seguir protocolos precisos y mantener técnicas asépticas estrictas es fundamental para lograr una criopreservación exitosa.
Esta guía ofrece instrucciones detalladas sobre los materiales y reactivos necesarios, así como procedimientos paso a paso para congelar células de manera efectiva y preservar al mismo tiempo su viabilidad y esterilidad. Al seguir estas pautas, los investigadores pueden almacenar con confianza y revivir posteriormente los cultivos celulares con una pérdida mínima de viabilidad celular, lo que mantiene la integridad y la confiabilidad de sus resultados experimentales.
Para comenzar, es esencial establecer un entorno de trabajo estéril. Las técnicas asépticas adecuadas desempeñan un papel crucial para prevenir la contaminación y garantizar la esterilidad de los cultivos.
Técnica aséptica
Siga las técnicas asépticas durante todo el proceso para garantizar la esterilidad de los cultivos.
Proceso integral de congelación celular
Este diagrama de flujo ofrece una guía visual detallada de los pasos esenciales que implica la congelación adecuada de las células. Siga estos procedimientos para garantizar una alta viabilidad e integridad celular durante el proceso de criopreservación.
Preparación del medio de congelación
Prepare el medio de congelación crioprotector de acuerdo con el tipo de célula:
- Cultivos en medios que contienen FBS: 90 % de FBS + 10 % de DMSO o 70 % de medio de crecimiento, 20 % de FBS y 10 % de DMSO
- Células que requieren glicerol: 90 % de FBS + 10 % de glicerol
Considere adquirir nuestro medio de congelación preformulado:
- Medio de congelación CM-1: para protocolos que requieren un medio que contenga suero fetal bovino (FBS)
- Medio de congelación CM-ACF —sin suero—: para una alternativa sin FBS
Etiquetado y documentación
Etiquete los criotubos con los siguientes datos:
- Fecha
- Nombre del investigador
- Número de células
- Número de pasaje
- Tipo de célula
- Cualquier información adicional (p. ej., modificaciones genéticas)
Preparación celular
Para células adherentes:
- Monitoree las células hasta que alcancen una confluencia del 85–95 %
- Aspirar el medio de cultivo usado
- Enjuagar la monocapa celular con PBS sin calcio ni magnesio
- Desprenda las células con Accutase, tripsina o tripsina-EDTA y neutralícelas con medio de cultivo si es necesario
- Transfiera la suspensión celular a un tubo Falcon de 50 mL
Para células en suspensión:
- Verificar la densidad y el estado de las células bajo el microscopio
- Transfiera la suspensión celular directamente a un tubo Falcon de 50 mL
Recuento celular y centrifugación
- Cuente las células utilizando un hemocitómetro o un contador celular automático
- Centrifugue a 300 g durante 3 a 5 minutos a temperatura ambiente para sedimentar las células
- Aspirar el sobrenadante con cuidado, evitando alterar el sedimento celular
- Calienta el medio de congelación preparado a 37 °C antes de usarlo
Criopreservación
- Resuspender el sedimento celular en el medio de congelación hasta alcanzar una densidad de 2.0 millones de células/mL para células adherentes y de 5 millones de células/mL para células en suspensión, o la concentración deseada
- Divida en alícuotas de 1,0 mL (o más, según sea necesario) de la suspensión celular en criotubos etiquetados
- Utilice un método de congelación lenta antes de transferir las células al almacenamiento a largo plazo
- ? Método
- ? Pasos
-
❄️
Congelación manual -
1️⃣ Coloca las células en medio de congelación en un congelador a 4 °C durante 40 minutos.
2️⃣ Transfiérelas a un congelador a -80 °C durante 24 horas.
3️⃣ Almacena las células en nitrógeno líquido para su conservación a largo plazo. -
?
Uso de Mr. Frosty -
1️⃣ Prepara las células en criotubos con medio de congelación.
2️⃣ Coloca los criotubos en el recipiente Mr. Frosty.
3️⃣ Almacena a -80 °C durante 24 horas antes de transferirlas a nitrógeno líquido. -
?
Congelador de velocidad controlada -
1️⃣ Programa el dispositivo para que la temperatura disminuya gradualmente.
2️⃣ Coloca las células preparadas en el congelador.
3️⃣ Después del ciclo de congelación, transfiere las células a nitrógeno líquido.
- Almacene los criotubos a temperaturas inferiores a -130 °C o en nitrógeno líquido para su conservación a largo plazo.
Materiales y reactivos
- Criotubos de 1–2 mL
- Unidad de congelación CoolCell® o congelador de velocidad controlada
- Medio crioprotector de congelación (p. ej., medios crioprotectores caseros, CM-1, CM-ACF o medios especializados)
- Suero fetal bovino (FBS) o medios acondicionados
- DMSO o glicerol
- PBS sin calcio ni magnesio
- Accutase, tripsina o tripsina-EDTA (para células adherentes)
- Tubos Falcon de 15 mL o 50 mL
- Hemocitómetro o contador celular automático
- Centrífuga