Células HaCaT

1. Eliminar o meio antigo: Remover cuidadosamente o meio de cultura antigo dos frascos.
2. Lavar as células: Adicionar 3-5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem cálcio e magnésio aos frascos T25, ou 5-10 ml aos frascos T75, para enxaguar as células aderentes.
3. Adicionar a solução de EDTA: Cobrir totalmente a camada de células com uma solução de EDTA a 0,05% recentemente preparada. Utilizar 1-2 ml para os frascos T25 e 2,5 ml para os frascos T75.
4. Incubar: Incubar os frascos a 37°C durante 10 minutos.
5. Adicionar solução de tripsina/EDTA ou TrypLE Express: Após a incubação, adicionar uma solução de tripsina/EDTA recém-preparada (0,05% de tripsina, 0,025% de EDTA) ou TrypLE Express aos frascos, assegurando que a camada de células fica totalmente coberta. Utilizar 1 ml para os frascos T25 e 2,5 ml para os frascos T75. (Nota: Os passos 3 e 4 podem ser omitidos se utilizar o TrypLE Express)
6. Monitorizar o descolamento: Observar as células ao microscópio. As células devem desprender-se no espaço de 1-5 minutos.
7. Neutralizar a tripsina: Adicionar meio de cultura celular contendo soro fetal bovino (FBS) para neutralizar a atividade da tripsina assim que as células se desprenderem.
8. Transferir as células: Distribuir a suspensão de células em novos frascos previamente cheios com meio de cultura fresco.

1. Confirme que o frasco permanece profundamente congelado aquando da entrega, uma vez que as células são enviadas em gelo seco para manter as temperaturas ideais durante o transporte.

2. Após a receção, armazenar o frasco criogénico imediatamente a temperaturas inferiores a -150°C para garantir a preservação da integridade celular, ou avançar para o passo 3 se for necessária uma cultura imediata.

3. Para uma cultura imediata, descongelar rapidamente o frasco imergindo-o num banho de água a 37°C com água limpa e um agente antimicrobiano, agitando suavemente durante 40-60 segundos até ficar um pequeno aglomerado de gelo.

4. Efetuar todos os passos subsequentes em condições estéreis numa capela de fluxo, desinfectando o frasco criogénico com etanol a 70% antes de o abrir.

5. Abrir cuidadosamente o frasco desinfectado e transferir a suspensão de células para um tubo de centrifugação de 15 ml contendo 8 ml de meio de cultura à temperatura ambiente, misturando suavemente.

6. Centrifugar a mistura a 300 x g durante 3 minutos para separar as células e eliminar cuidadosamente o sobrenadante que contém o meio de congelação residual.

7. Ressuspender suavemente o pellet de células em 10 ml de meio de cultura fresco. No caso de células aderentes, dividir a suspensão entre dois frascos de cultura T25; no caso de culturas em suspensão, transferir todo o meio para um frasco T25 para promover uma interação e um crescimento eficazes das células.

8. Cumprir os protocolos de subcultura estabelecidos para o crescimento e manutenção contínuos da linha celular, garantindo resultados experimentais fiáveis.

37°C, 5%_CO2, atmosfera humidificada.

Para uma fixação e viabilidade óptimas após a descongelação, recomendamos a utilização de frascos ou placas revestidos com colagénio.

As linhas celulares criopreservadas são expedidas em gelo seco em embalagens validadas e isoladas com refrigerante suficiente para manter aproximadamente -78 °C durante o transporte. Aquando da receção, inspecionar imediatamente o recipiente e transferir sem demora os frascos para um local de armazenamento adequado.

As linhas celulares criopreservadas são expedidas em gelo seco em embalagens validadas e isoladas com refrigerante suficiente para manter aproximadamente -78 °C durante o transporte. Aquando da receção, inspecionar imediatamente o recipiente e transferir sem demora os frascos para um local de armazenamento adequado.

Para conservação a longo prazo, colocar os frascos em azoto líquido em fase de vapor a uma temperatura entre -150 e -196 °C. O armazenamento a -80 °C é aceitável apenas como um curto passo intermédio antes da transferência para azoto líquido.

A contaminação por micoplasma é excluída utilizando ensaios baseados em PCR e métodos de deteção de micoplasma baseados em luminescência.

Para garantir que não há contaminação bacteriana, fúngica ou de leveduras, as culturas de células são sujeitas a inspecções visuais diárias.