Komórki HaCaT

1. Wyrzucić starą pożywkę: Ostrożnie usunąć starą pożywkę z kolb.
2. Płukanie komórek: Dodaj 3-5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez wapnia i magnezu do kolb T25 lub 5-10 ml do kolb T75, aby przepłukać przylegające komórki.
3. Dodać roztwór EDTA: Całkowicie przykryj warstwę komórek świeżo przygotowanym 0,05% roztworem EDTA. Użyj 1-2 ml dla kolb T25 i 2,5 ml dla kolb T75.
4. Inkubacja: Inkubować kolby w temperaturze 37°C przez 10 minut.
5. Dodajroztwór Trypsin/EDTA lub TrypLE Express Solution: Po inkubacji dodaj świeżo przygotowany roztwór trypsyny/EDTA (0,05% trypsyny, 0,025% EDTA) lub TrypLE Express do kolb, upewniając się, że warstwa komórek jest w pełni pokryta. Użyj 1 ml dla kolb T25 i 2,5 ml dla kolb T75. (Uwaga: Kroki 3 i 4 można pominąć w przypadku korzystania z TrypLE Express)
6. Monitorowanie oderwania: Obserwuj komórki pod mikroskopem. Komórki powinny oddzielić się w ciągu 1-5 minut.
7. Zneutralizować trypsynę: Dodaj pożywkę do hodowli komórkowej zawierającą płodową surowicę bydlęcą (FBS), aby zneutralizować aktywność trypsyny, gdy tylko komórki się odłączą.
8. Przenieś komórki: Przenieś zawiesinę komórek do nowych kolb wypełnionych świeżym podłożem hodowlanym.

1. Upewnij się, że fiolka pozostaje głęboko zamrożona w momencie dostawy, ponieważ komórki są wysyłane w suchym lodzie, aby utrzymać optymalną temperaturę podczas transportu.

2. Po otrzymaniu należy natychmiast przechowywać fiolkę w temperaturze poniżej -150°C, aby zapewnić zachowanie integralności komórek, lub przejść do kroku 3, jeśli wymagana jest natychmiastowa hodowla.

3. W przypadku natychmiastowej hodowli należy szybko rozmrozić fiolkę, zanurzając ją w łaźni wodnej o temperaturze 37°C z czystą wodą i środkiem przeciwdrobnoustrojowym, delikatnie mieszając przez 40-60 sekund, aż pozostanie niewielka grudka lodu.

4. Wykonaj wszystkie kolejne kroki w sterylnych warunkach w kapturze przepływowym, dezynfekując fiolkę 70% etanolem przed otwarciem.

5. Ostrożnie otworzyć zdezynfekowaną fiolkę i przenieść zawiesinę komórek do 15 ml probówki wirówkowej zawierającej 8 ml podłoża hodowlanego o temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając.

6. Wirować mieszaninę z prędkością 300 x g przez 3 minuty w celu oddzielenia komórek i ostrożnie odrzucić supernatant zawierający pozostałości pożywki do zamrażania.

7. Delikatnie ponownie zawiesić osad komórek w 10 ml świeżego podłoża hodowlanego. W przypadku komórek przylegających, rozdzielić zawiesinę pomiędzy dwie kolby hodowlane T25; w przypadku hodowli zawiesinowych, przenieść całą pożywkę do jednej kolby T25 w celu promowania skutecznej interakcji i wzrostu komórek.

8. Przestrzegaj ustalonych protokołów podhodowli w celu ciągłego wzrostu i utrzymania linii komórkowej, zapewniając wiarygodne wyniki eksperymentów.

37°C, 5%_CO2, nawilżona atmosfera.

W celu zapewnienia optymalnego przylegania i żywotności po rozmrożeniu zalecamy stosowanie kolb lub płytek pokrytych kolagenem.

Linie komórkowe poddane kriokonserwacji są wysyłane w suchym lodzie w zatwierdzonych, izolowanych opakowaniach z wystarczającą ilością czynnika chłodniczego, aby utrzymać temperaturę około -78°C przez cały czas transportu. Po otrzymaniu przesyłki należy natychmiast sprawdzić pojemnik i bezzwłocznie przenieść fiolki do odpowiedniego miejsca przechowywania.

Linie komórkowe poddane kriokonserwacji są wysyłane w suchym lodzie w zatwierdzonych, izolowanych opakowaniach z wystarczającą ilością czynnika chłodniczego, aby utrzymać temperaturę około -78°C przez cały czas transportu. Po otrzymaniu przesyłki należy natychmiast sprawdzić pojemnik i bezzwłocznie przenieść fiolki do odpowiedniego miejsca przechowywania.

W celu długotrwałego przechowywania należy umieścić fiolki w ciekłym azocie w fazie lotnej w temperaturze od -150 do -196 °C. Przechowywanie w temperaturze -80 °C jest dopuszczalne tylko jako krótki etap przejściowy przed przeniesieniem do ciekłego azotu.

Zanieczyszczenie mykoplazmą jest wykluczane przy użyciu zarówno testów opartych na PCR, jak i metod wykrywania mykoplazmy opartych na luminescencji.

Aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia bakteriami, grzybami lub drożdżami, hodowle komórkowe są poddawane codziennym kontrolom wizualnym.