Cellules HaCaT

1. Jeter l'ancien milieu: Retirer soigneusement l'ancien milieu de culture des flacons.
2. Laver les cellules: Ajouter 3-5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium ni magnésium dans les flacons T25, ou 5-10 ml dans les flacons T75, pour rincer les cellules adhérentes.
3. Ajouter la solution d'EDTA: Recouvrir entièrement la couche de cellules avec une solution d'EDTA à 0,05 % fraîchement préparée. Utiliser 1 à 2 ml pour les flacons T25 et 2,5 ml pour les flacons T75.
4. Incuber: Incuber les flacons à 37°C pendant 10 minutes.
5. Ajouter la solution Trypsine/EDTA ou TrypLE Express: Après incubation, ajouter une solution de trypsine/EDTA fraîchement préparée (0,05 % de trypsine, 0,025 % d'EDTA) ou TrypLE Express dans les flacons, en veillant à ce que la couche cellulaire soit entièrement recouverte. Utiliser 1 ml pour les flacons T25 et 2,5 ml pour les flacons T75. (Remarque : les étapes 3 et 4 peuvent être omises si l'on utilise TrypLE Express)
6. Surveiller le détachement: Observer les cellules au microscope. Les cellules devraient se détacher en 1 à 5 minutes.
7. Neutraliser la trypsine: Ajouter du milieu de culture cellulaire contenant du sérum bovin fœtal (FBS) pour neutraliser l'activité de la trypsine dès que les cellules se sont détachées.
8. Transférer les cellules: Distribuer la suspension cellulaire dans de nouveaux flacons pré-remplis de milieu de culture frais.

1. Confirmer que le flacon est toujours congelé à la livraison, car les cellules sont expédiées sur de la glace sèche pour maintenir des températures optimales pendant le transport.

2. Dès réception, soit conserver immédiatement le cryovial à des températures inférieures à -150°C pour assurer la préservation de l'intégrité cellulaire, soit passer à l'étape 3 si une mise en culture immédiate est nécessaire.

3. Pour une mise en culture immédiate, décongeler rapidement le flacon en l'immergeant dans un bain-marie à 37°C avec de l'eau propre et un agent antimicrobien, en l'agitant doucement pendant 40 à 60 secondes jusqu'à ce qu'il ne reste qu'un petit amas de glace.

4. Effectuer toutes les étapes suivantes dans des conditions stériles sous une hotte à flux, en désinfectant le cryovial avec de l'éthanol à 70 % avant de l'ouvrir.

5. Ouvrir soigneusement le flacon désinfecté et transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 8 ml de milieu de culture à température ambiante, en mélangeant doucement.

6. Centrifuger le mélange à 300 x g pendant 3 minutes pour séparer les cellules et jeter soigneusement le surnageant contenant le milieu de congélation résiduel.

7. Remettre doucement en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu de culture frais. Pour les cellules adhérentes, répartir la suspension entre deux flacons de culture T25 ; pour les cultures en suspension, transférer tout le milieu dans un seul flacon T25 afin de favoriser une interaction et une croissance efficaces des cellules.

8. Respecter les protocoles de sous-culture établis pour une croissance et un entretien continus de la lignée cellulaire, garantissant ainsi des résultats expérimentaux fiables.

37°C, 5%_CO2, atmosphère humidifiée.

Pour une fixation et une viabilité optimales après décongélation, nous recommandons d'utiliser des flacons ou des plaques recouverts de collagène.

Les lignées cellulaires cryoconservées sont expédiées sur glace sèche dans des emballages isolés et validés, avec suffisamment de réfrigérant pour maintenir une température d'environ -78 °C tout au long du transport. À la réception, inspecter immédiatement le conteneur et transférer sans délai les flacons dans un lieu de stockage approprié.

Les lignées cellulaires cryoconservées sont expédiées sur glace sèche dans des emballages isolés et validés, avec suffisamment de réfrigérant pour maintenir une température d'environ -78 °C tout au long du transport. À la réception, inspecter immédiatement le conteneur et transférer sans délai les flacons dans un lieu de stockage approprié.

Pour une conservation à long terme, placer les flacons dans de l'azote liquide en phase vapeur à une température comprise entre -150 et -196 °C environ. Le stockage à -80 °C n'est acceptable qu'en tant qu'étape intermédiaire de courte durée avant le transfert dans l'azote liquide.

La contamination par les mycoplasmes est exclue à l'aide de tests basés sur la PCR et de méthodes de détection des mycoplasmes basées sur la luminescence.

Pour s'assurer de l'absence de contamination bactérienne, fongique ou levurienne, les cultures cellulaires font l'objet d'inspections visuelles quotidiennes.