Buňky HaCaT

1. Vyřazení starého média: Z baněk opatrně odstraňte staré kultivační médium.
2. Promyjte buňky: Přidejte 3-5 ml fyziologického roztoku (PBS) bez vápníku a hořčíku do baněk T25 nebo 5-10 ml do baněk T75, abyste opláchli adherující buňky.
3. Přidejte roztok EDTA: Vrstvu buněk zcela pokryjte čerstvě připraveným 0,05% roztokem EDTA. Použijte 1-2 ml pro baňky T25 a 2,5 ml pro baňky T75.
4. Inkubace: Inkubujte baňky při 37 °C po dobu 10 minut.
5. Přidejte roztok Trypsin/EDTA nebo TrypLE Express: Po inkubaci přidejte do baněk čerstvě připravený roztok trypsinu/EDTA (0,05 % trypsin, 0,025 % EDTA) nebo TrypLE Express, aby byla buněčná vrstva zcela pokryta. Použijte 1 ml pro baňky T25 a 2,5 ml pro baňky T75. (Poznámka: Kroky 3 a 4 lze při použití přípravku TrypLE Express vynechat.)
6. Monitorujte oddělování: Pozorujte buňky pod mikroskopem. Buňky by se měly oddělit během 1-5 minut.
7. Neutralizujte trypsin: Jakmile se buňky oddělí, přidejte buněčné kultivační médium obsahující fetální hovězí sérum (FBS) k neutralizaci trypsinové aktivity.
8. Přeneste buňky: Dávkujte buněčnou suspenzi do nových baněk předem naplněných čerstvým kultivačním médiem.

1. Ověřte si, že lahvička zůstane při dodání hluboce zmražená, protože buňky se přepravují na suchém ledu, aby se během přepravy udržely optimální teploty.

2. Po obdržení kryovialku buď okamžitě uložte při teplotě nižší než -150 °C, abyste zajistili zachování buněčné integrity, nebo přejděte ke kroku 3, pokud je nutná okamžitá kultivace.

3. Pro okamžitou kultivaci rychle rozmrazte lahvičku ponořením do vodní lázně o teplotě 37 °C s čistou vodou a antimikrobiálním prostředkem a jemně ji míchejte po dobu 40-60 sekund, dokud nezůstane malý ledový chuchvalec.

4. Všechny další kroky provádějte za sterilních podmínek v průtokové digestoři a před otevřením kryovialku dezinfikujte 70% ethanolem.

5. Opatrně otevřete dezinfikovanou lahvičku a přeneste buněčnou suspenzi do 15 ml centrifugační zkumavky obsahující 8 ml kultivačního média o pokojové teplotě a jemně promíchejte.

6. Směs odstřeďujte při 300 x g po dobu 3 minut, aby se buňky oddělily, a supernatant obsahující zbytky mrazicího média opatrně zlikvidujte.

7. Pelety buněk jemně resuspendujte v 10 ml čerstvého kultivačního média. U adherentních buněk rozdělte suspenzi mezi dvě kultivační baňky T25; u suspenzních kultur přeneste veškeré médium do jedné baňky T25, abyste podpořili účinnou interakci a růst buněk.

8. Dodržujte zavedené subkultivační protokoly pro kontinuální růst a udržování buněčné linie, čímž zajistíte spolehlivé výsledky experimentů.

37 °C, 5 %_CO2, zvlhčená atmosféra.

Pro optimální uchycení a životaschopnost po rozmrazení doporučujeme používat baňky nebo destičky potažené kolagenem.

Kryokonzervované buněčné linie se přepravují na suchém ledu v ověřených, izolovaných obalech s dostatečným množstvím chladiva, aby se po celou dobu přepravy udržovala teplota přibližně -78 °C. Po obdržení ihned zkontrolujte obal a neprodleně přeneste lahvičky do vhodného skladu.

Kryokonzervované buněčné linie se přepravují na suchém ledu v ověřených, izolovaných obalech s dostatečným množstvím chladiva, aby se po celou dobu přepravy udržovala teplota přibližně -78 °C. Po obdržení ihned zkontrolujte obal a neprodleně přeneste lahvičky do vhodného skladu.

Pro dlouhodobé uchování umístěte lahvičky do kapalného dusíku v plynné fázi při teplotě přibližně -150 až -196 °C. Skladování při -80 °C je přijatelné pouze jako krátký přechodný krok před přemístěním do kapalného dusíku.

Kontaminace mykoplazmaty je vyloučena jak pomocí testů založených na PCR, tak pomocí luminiscenčních metod detekce mykoplazmy.

Aby se zajistilo, že nedojde ke kontaminaci bakteriemi, plísněmi nebo kvasinkami, jsou buněčné kultury denně podrobovány vizuálním kontrolám.