Клетки HaCaT

1. Изхвърлете стария носител: Внимателно отстранете старата хранителна среда от колбите.
2. Измийте клетките: Добавете 3-5 ml фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) без калций и магнезий в колби Т25 или 5-10 ml в колби Т75, за да изплакнете прилепналите клетки.
3. Добавете разтвор на EDTA: Покрийте изцяло клетъчния слой с прясно приготвен 0,05% разтвор на EDTA. Използвайте 1-2 ml за колби Т25 и 2,5 ml за колби Т75.
4. Инкубиране: Инкубирайте колбите при 37 °C за 10 минути.
5. Добавете разтвор на трипсин/EDTA или TrypLE Express: След инкубацията добавете прясно приготвен разтвор на трипсин/EDTA (0,05 % трипсин, 0,025 % EDTA) или TrypLE Express към колбите, като се уверите, че клетъчният слой е напълно покрит. Използвайте 1 ml за колби Т25 и 2,5 ml за колби Т75. (Забележка: Стъпки 3 и 4 могат да се пропуснат, ако се използва TrypLE Express.)
6. Наблюдавайте отделянето: Наблюдавайте клетките под микроскоп. Клетките трябва да се отделят в рамките на 1-5 минути.
7. Неутрализирайте трипсина: Добавете среда за клетъчни култури, съдържаща фетален говежди серум (FBS), за да неутрализирате активността на трипсина веднага след отделянето на клетките.
8. Прехвърляне на клетките: Прехвърлете клетъчната суспензия в нови колби, предварително напълнени с прясна хранителна среда.

1. Уверете се, че флаконът остава дълбоко замразен при доставката, тъй като клетките се транспортират със сух лед, за да се поддържат оптимални температури по време на транспортирането.

2. При получаване или съхранявайте незабавно криовиолата при температури под -150 °C, за да осигурите запазване на клетъчната цялост, или преминете към стъпка 3, ако е необходимо незабавно култивиране.

3. За незабавно култивиране бързо размразете флакона, като го потопите във водна баня с чиста вода и антимикробен агент с температура 37 °C, като разбърквате внимателно в продължение на 40-60 секунди, докато остане малка ледена бучка.

4. Извършвайте всички следващи стъпки при стерилни условия в аспиратор, като преди отваряне дезинфекцирате криовиолата със 70% етанол.

5. Внимателно отворете дезинфекцирания флакон и прехвърлете клетъчната суспензия в 15 ml центрофужна епруветка, съдържаща 8 ml хранителна среда със стайна температура, като разбъркате внимателно.

6. Центрофугирайте сместа при 300 x g в продължение на 3 минути, за да отделите клетките, и внимателно изхвърлете супернатантата, съдържаща остатъчна замразяваща среда.

7. Внимателно ресуспендирайте клетъчната пелета в 10 ml прясна хранителна среда. За адхезивни клетки разделете суспензията между две колби Т25; за суспензионни култури прехвърлете цялата среда в една колба Т25, за да стимулирате ефективното взаимодействие и растеж на клетките.

8. Придържайте се към установените протоколи за субкултивиране за непрекъснат растеж и поддържане на клетъчната линия, като гарантирате надеждни експериментални резултати.

37°C, 5%_CO2, овлажнена атмосфера.

За оптимално прикрепване и жизнеспособност след размразяване препоръчваме да се използват колби или плаки с колагеново покритие.

Криоконсервираните клетъчни линии се транспортират върху сух лед във валидирана, изолирана опаковка с достатъчно хладилен агент, за да се поддържа приблизително -78 °C по време на транспортирането. При получаването незабавно прегледайте опаковката и незабавно прехвърлете флаконите за подходящо съхранение.

Криоконсервираните клетъчни линии се транспортират върху сух лед във валидирана, изолирана опаковка с достатъчно хладилен агент, за да се поддържа приблизително -78 °C по време на транспортирането. При получаването незабавно прегледайте опаковката и незабавно прехвърлете флаконите за подходящо съхранение.

За дълготрайно съхранение поставете флаконите в течен азот в парна фаза при температура около -150 до -196 °C. Съхранението при -80 °C е приемливо само като кратък междинен етап преди прехвърлянето в течен азот.

Замърсяването с микоплазма се изключва както чрез PCR-базирани анализи, така и чрез луминесцентни методи за откриване на микоплазма.

За да се гарантира, че няма бактериално, гъбично или дрождево замърсяване, клетъчните култури се подлагат на ежедневни визуални проверки.