对 HEK293 进行代谢工程以增强蛋白质糖基化
糖基化是影响治疗蛋白疗效、稳定性和免疫原性的最关键的翻译后修饰之一。在 Cytion，我们深知生产具有最佳糖基谱的重组蛋白需要对细胞代谢和糖基化机制有深入的了解。HEK293 细胞为糖蛋白的生产提供了一个独具优势的平台，因为它源自人类，能确保类似于原生糖基化模式，与内源性人类蛋白质密切相关--这是它优于非人类表达系统的重要优势。
主要启示
- HEK293 细胞可产生与人类相容的糖蛋白结构，在某些治疗方面优于 CHO 细胞
- 补充核苷酸糖前体可直接提高糖基化位点的占有率
- 培养条件（包括温度、pH 值和溶解氧）对聚糖结构有深远影响
- 基因工程方法可为特定治疗应用定制聚糖结构
- 分析表征策略对糖蛋白质量评估至关重要
HEK293 细胞的糖基化优势
人胚胎肾脏 293 细胞具有不同于其他哺乳动物表达系统的糖基化能力。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞只产生α2,3-连接的硅烷酸，而 HEK293 细胞同时表达α2,3-和α2,6-硅烷基转移酶，产生的糖基结构更接近原生人类糖蛋白。
这种区别具有重要的治疗意义。许多人类血清糖蛋白，包括免疫球蛋白和凝血因子，都含有大量α2,6-连接的硅醛酸。因此，与 CHO 衍生的同类产品相比，用 HEK293 细胞生产的治疗蛋白可能会显示出更好的药代动力学特征并降低免疫原性。
我们的HEK293 细胞 (300192)为糖蛋白的生产提供了一个极好的起点，在保持原生糖基化机制的同时，还具有稳健的生长特性。对于需要提高转染效率的应用，我们的HEK293T 细胞 (300189)可实现快速表达研究。
核苷酸糖代谢和前体工程
糖基化效率从根本上取决于内质网和高尔基体内核苷酸糖供体的可用性。这些活化的糖分子--包括 UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-N-乙酰葡糖胺、GDP-甘露糖、GDP-岩藻糖和 CMP-糖醛酸--是构建糖链的糖基转移酶的底物。
代谢工程方法可通过多种机制提高核苷酸糖池。在培养基中直接补充单糖，如半乳糖、甘露糖或 N-乙酰甘露糖胺（ManNAc），可提供细胞可转化为相应核苷酸糖的挽救途径底物。10-40 mM 的 ManNAc 补充剂已被证明能显著提高各种细胞系的硅氨酰化水平。
基因方法提供了更持久的解决方案。过表达核苷酸糖生物合成途径中的关键酶--包括 CMP-硅酸合成酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶或 GDP-甘露糖焦磷酸化酶--可持续提高前体池的水平，而无需补充培养基。
优化培养条件以提高糖基质量
环境参数对糖基化结果有着深远的影响，其对糖谱的影响往往不亚于基因修饰。在生产阶段将温度从 37°C 降至 32-34°C，已被一致证明能提高糖基化，这可能是通过延长蛋白质在高尔基体中的停留时间和降低糖苷酶活性的综合作用实现的。
培养液的 pH 值会影响糖基转移酶的活性和聚糖的稳定性。一般来说，pH 值保持在 6.8 到 7.2 之间有助于达到最佳糖基化效果，但具体的最佳值可能因目标蛋白质和所需的聚糖谱而异。
溶解氧水平会影响细胞代谢，进而影响糖基化。低氧条件（空气饱和度低于 20%）会损害细胞生长和生产力，而适度的氧气水平（空气饱和度 30%-50%）通常能支持强大的糖基化。高氧条件可能会产生活性氧，损害糖蛋白或干扰糖基化机制。
我们的DMEM:Ham's F12 (1:1) 培养基 (820400a)为糖蛋白生产提供了极佳的基础配方，其均衡的营养成分可支持细胞生长和翻译后处理。
用于定制糖基化的基因工程
现代基因工程工具可以精确改造 HEK293 的糖基化能力，生产出具有定制糖基结构的蛋白质。CRISPR/Cas9 技术为这一领域带来了革命性的变化，它可以高效地敲除特定的糖基转移酶或引入新的酶活性。
糖基化抗体是糖工程学的一个突出应用。敲除编码α1,6-岩藻糖基转移酶的 FUT8 基因可以消除 N-聚糖中的核心岩藻糖基化。经岩藻糖基化的抗体具有显著增强的抗体依赖性细胞毒性（ADCC），这是肿瘤治疗的理想特性。
相反，糖基转移酶的过度表达也能增强特定修饰。引入β1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶III（GnT-III）可产生具有双截N-乙酰葡糖胺的抗体，这是另一种与增强效应功能相关的修饰。过量表达半乳糖基转移酶和半乳糖氨酰基转移酶可增加末端糖封端，从而可能延长血清半衰期。
对于支持大规模糖蛋白生产的悬浮培养应用，我们的HEK293 悬浮适配 (300686)细胞可以进一步工程化，加入所需的糖基化修饰。
糖基化评估的分析策略
全面的聚糖表征需要多种互补的分析方法。利用亲水作用液相色谱法（HILIC）和荧光检测法进行释放聚糖分析，可提供灵敏度极高的详细聚糖谱分析。质谱法可增加结构确认功能，并能识别意想不到的修饰。
位点特异性糖基化分析解决了糖蛋白固有的异质性问题。使用 LC-MS/MS 进行糖肽图谱绘制，可以揭示单个糖基化位点的占据情况以及每个位点的糖基结构。这些信息对于了解结构-功能关系和确保批次间的一致性至关重要。
快速筛选方法支持工艺开发和质量控制。基于凝集素的检测方法、毛细管电泳和聚糖特异性抗体可对关键聚糖属性进行高通量评估，而无需进行大量的样品制备。
推荐用于糖蛋白生产的产品：
- HEK293 细胞 (300192)- 原生人类糖基化模式
- HEK293T 细胞 (300189)- 转染效率高，适合快速研究
- HEK293 悬浮适配 (300686)- 可扩展的生产平台
- DMEM:Ham's F12 (1:1) (820400a)- 优化糖蛋白生产