基于 HEK 细胞的高通量 GPCR 筛选平台

G 蛋白偶联受体（GPCR）是人类基因组中最大的膜蛋白家族，约占所有药物靶点的 34%。在 Cytion，我们认识到开发有效的 GPCR 靶向疗法需要强大的基于细胞的筛选平台，能够准确测量数千到数百万化合物的受体激活情况。HEK293 细胞已成为 GPCR 表达和功能筛选的首选宿主，它具有高效受体表达、低内源性受体本底以及兼容多种检测格式等独特优势。

主要启示

• HEK293 细胞为异源 GPCR 表达提供了理想的背景，内源性受体的干扰极小
• 多种检测形式--钙通量、cAMP、β-arrestin 招募--实现了全面的通路检测
• 自动液体处理和平板阅读器使每天的筛选量超过 100,000 个化合物
• 稳定的细胞系开发策略兼顾了产量要求和检测一致性
• 有偏差的激动检测需要不同信号级联的多重读数

HEK293 细胞为何在 GPCR 筛选中表现出色

HEK293 细胞具有多种内在优势，已成为 GPCR 功能测定的事实标准。首先，HEK293 细胞的内源性 GPCR 表达量相对较低，最大程度地减少了可能干扰异源受体研究的背景信号。与某些以功能相关水平表达大量 GPCR 的癌症衍生细胞系不同，HEK293 细胞为受体表达提供了一个干净的平台。

其次，HEK293 细胞表达所有主要的 G 蛋白亚类（Gαs、Gαi、Gαq、Gα12/13），其表达水平足以支持不同的受体偶联。这种完整的信号转导程序能够检测原生受体与 G 蛋白的相互作用，而不需要共同表达特定的 G 蛋白亚基。

第三，HEK293 细胞使用多种试剂进行高效转染，转染率超过 90%。这种效率可转化为高受体表达水平--每个细胞通常有 10 ⁵ 至 10 ⁶ 受体--即使对偶联效率不高的受体也能提供强大的信号窗口。

我们的HEK293T 细胞 (300189)在瞬时 GPCR 表达方面具有特别高的转染效率，因此非常适合在生成稳定细胞系之前进行初步的受体表征和检测开发。

用于 GPCR 筛选的测定格式选择

钙通量测定：Gαq 偶联受体激活磷脂酶 C，引发细胞内储存的钙释放。对钙敏感的荧光染料（如 Fluo-4、Fura-2 或基因编码的钙指示剂）可对这种反应进行实时测量。基于平板的荧光阅读器（如 FLIPR）可同时测量整个 384 孔或 1536 孔板的钙瞬态，每天的吞吐量可超过 100,000 个数据点。

cAMP 检测：Gαs 偶联受体刺激腺苷酸环化酶，增加细胞内 cAMP，而 Gαi 偶联受体则抑制 cAMP 的产生。有多种检测技术可以检测 cAMP 的变化，包括竞争性免疫测定（HTRF、AlphaScreen）、基于生物传感器的方法（GloSensor）和报告基因检测（CRE-荧光素酶）。每种方法都在灵敏度、动力学和通量方面具有独特的优势。

β-Arrestin 募集：GPCR 激活会引发 β-restin 募集到受体，这一过程可通过蛋白质互补检测进行测量。PathHunter（酶片段互补）和 NanoBiT（分裂荧光素酶）等技术可提供灵敏、不依赖于通路的读数，适用于各种受体类别，与 G 蛋白偶联偏好无关。

报告基因检测：转录报告系统可测量下游信号转导事件，并提供可提高灵敏度的放大功能。CRE-luciferase 报告基因可检测 cAMP 通路的激活，NFAT-luciferase 可响应钙信号，SRE-luciferase 可监测多种通路。虽然报告程序比直接测量第二信使慢，但却能提供出色的信号-背景比。

稳定细胞系开发策略

高通量筛选活动通常需要在数十亿个检测孔中以一致的水平表达目标 GPCR 的稳定细胞系。稳定品系的开发首先要设计载体，同时包含受体和可选择标记，这样才能富集稳定转染的细胞。

我们的HEK293 细胞 (300192)是生成稳定细胞系的标准亲本。转染和抗生素选择（通常为 2-4 周）后，存活的细胞通过极限稀释或荧光激活细胞分选（FACS）进行单细胞克隆。然后对单个克隆进行扩增，并对受体表达水平、功能反应幅度和检测稳健性进行鉴定。

筛选细胞系的关键质量属性包括：经过长时间扩增后的表达稳定性、与参考标准相比一致的药理学以及在微型化平板格式中的稳健性能。应在筛选活动的早期建立合格的细胞库，以确保整个筛选过程中性能的一致性。

为了加快进度，我们的HEK293 EBNA 细胞 (300264)可实现外显子载体的稳定表达，从而在保持表达一致性的同时缩短开发时间。

微型化和自动化注意事项

要最大限度地提高筛选吞吐量，就必须微型化到 384 孔、1536 孔甚至 3456 孔格式。HEK293 细胞能很好地适应体积缩小后的高密度培养，但每次格式转换可能都需要优化细胞密度、培养条件和孵育时间。

悬浮适配 HEK293 细胞为自动筛选工作流程提供了优势。我们的悬浮适配 HEK293 (300686)细胞可直接从培养容器分装到检测板中，无需胰蛋白酶化，从而减少了处理步骤并提高了一致性。这种与自动液体处理机的兼容性使真正的即用型筛选活动成为可能。

化验板稳定性要求因格式而异。钙通量测定通常要求在染料加载后数小时内进行测量，而 cAMP 和 β-阻遏素测定则允许在读数前过夜孵育。了解这些限制因素有助于筛选物流和设备调度。

数据分析和基因突变鉴定

GPCR 筛选活动会产生大量数据集，需要强大的分析管道。统计参数包括 Z'-因子、信号-背景比和变异系数，可逐板评估检测质量。未达到质量阈值的平板应重复检测，而不是进行分析。

命中识别标准要兼顾灵敏度和假阳性率。相对于参考化合物，50% 的激活或抑制活性阈值提供了合理的起点，但最佳临界值取决于库的组成和计划目标。对主要发现的化合物进行浓度-反应确认，可消除假阳性反应，并为后续化合物排序。

现代 GPCR 药物发现越来越重视偏激激动作用--即优先激活某些信号通路而非其他信号通路的化合物。要检测出有偏倚的化合物，需要对多种通路（如 G 蛋白激活与 β-阻遏蛋白招募）进行平行测定，并仔细关注测定灵敏度和动力学，以避免出现技术偏差。

推荐用于 GPCR 筛选的产品：

• HEK293T 细胞 (300189)- 高效瞬时表达
• HEK293 细胞 (300192)- 生成稳定的细胞系
• HEK293 悬浮适配 (300686)- 自动化筛选工作流程
• HEK293 EBNA 细胞 (300264)- 加速稳定品系的开发
• DMEM 高葡萄糖 (820300a)- 标准培养基