循环肿瘤细胞 (CTC) 培养：挑战与新兴解决方案

循环肿瘤细胞是从原发肿瘤或转移部位脱落并进入血液的罕见癌细胞群体，既是肿瘤转移的媒介，也是肿瘤实时信息的潜在来源。在 Cytion，我们认识到，成功培养 CTC 可以利用通过微创抽血获得的患者自身肿瘤细胞进行功能性药物测试、基因组表征和机理研究，从而彻底改变个性化癌症医学。然而，CTC 培养面临着非同寻常的技术挑战：这些细胞异常稀少（在数十亿正常血细胞中，每毫升血液中通常只有不到 10 个细胞）、高度异质性、脆弱，而且在分离和培养过程中容易丢失。尽管存在这些障碍，最近的技术进步使 CTC 培养变得越来越可行，为精准肿瘤学开辟了新途径。

CTCs 的生物学和临床意义

CTC 从原发性肿瘤和转移性病灶脱落进入血液循环，它们的存在与许多癌症类型的疾病进展和预后有关。这些细胞面临着恶劣的环境--流动血液中的剪切应力、免疫监视、缺乏基质附着--大多数细胞会迅速死亡。极少数存活下来的 CTCs 具备转移潜能的特性：对 anoikis（脱落诱导的细胞死亡）的抵抗力、悬浮存活的能力以及外渗和定植到远处器官的能力。对 CTCs 进行培养，可以前所未有地接触到这些转移性前体，并对其进行功能特征描述，而单靠基因组分析是无法揭示这些特征的。然而，CTC 的稀缺性和脆弱性使其培养成为细胞生物学中技术要求最高的程序之一。

分离技术：关键第一步

在培养 CTC 之前，必须将它们从过量的正常血细胞中分离出来。物理分离方法是利用过滤或微流体设备的大小差异（CTC 通常比血细胞大）。免疫亲和法利用抗体涂层表面或磁珠捕获表达 EpCAM 等上皮标记的 CTC。然而，这些方法都有局限性：并非所有的 CTC 都是大的或表达 EpCAM，尤其是那些正在经历上皮-间质转化（EMT）的 CTC。负性去污法能去除血细胞，而不触及 CTC，但纯度仍是一个挑战。理想的分离培养方法必须温和，既能保持细胞活力，又能达到足够的富集和纯度，防止血细胞过度生长。

粘附问题

粘附细胞通常需要附着在细胞外基质上才能存活；一旦脱离，它们就会发生anoikis，这是一种程序性细胞死亡。血液循环中的 CTC 必须克服 Anoikis 才能存活，但即使是这些顽强的细胞在分离和过渡到培养过程中也会承受巨大的压力。克服嗜酸性的策略包括：立即将细胞培养到涂有基质的表面、在提供结构支持的三维基质中培养、补充胰岛素样生长因子或表皮生长因子等生存因子，或与提供生存信号的支持性饲养细胞共同培养。分离后关键的 24-48 小时决定了 CTC 是适应培养条件还是死于脱落诱导的死亡。

从稀有细胞开始增殖

即使 CTC 在分离后存活下来，从极少量细胞中启动增殖也是一项独特的挑战。标准细胞培养通常依赖于细胞间的旁分泌信号，但当只有少量 CTC 存在时，这些信号是不够的。已建立的癌细胞系或正常细胞和细胞系的条件培养基可提供必要的因子。生长受阻细胞的供养层可在不争夺资源的情况下提供旁分泌信号。微孔阵列可将单个 CTC 限制在小体积内，使分泌因子达到有效浓度。专为低密度培养而优化的培养基配方包括高浓度的生长因子和支持受压细胞的额外补充剂。目的是创造一种微环境，克服极端低密度的限制。

三维培养方法

三维培养系统特别适合 CTC 扩增。将 CTC 嵌入 Matrigel、胶原蛋白或合成水凝胶中，可提供基质附着点，防止 Anoikis，同时实现三维组织。类器官培养方法已被证明可成功用于正常组织和原发性肿瘤的培养，也可支持 CTC 生长，单个 CTC 可形成小肿瘤样结构。与传统的单层培养法相比，这些三维培养法可以更好地保存 CTC 表型，因为它们能保持与体内肿瘤更相似的细胞结构和信号传导环境。有些系统将三维培养与微流体灌注结合起来，提供营养输送和废物清除，创造出支持长期 CTC 培养的微型肿瘤微环境。

饲养细胞系统

与饲养细胞共培养是 CTC 扩增的另一种策略。经过辐照或丝裂霉素处理的成纤维细胞、内皮细胞甚至癌症相关成纤维细胞可提供生长因子、基质蛋白和代谢支持，而自身不会增殖。然而，供养系统带来了复杂性：要区分 CTC 和供养细胞需要仔细追踪，可能通过荧光标记或独特的形态。最终，必须通过选择性培养基、差异胰蛋白酶化或免疫磁分选等方法将 CTC 与馈源分离。尽管存在这些挑战，进样器系统还是实现了无进样器条件下难以达到的 CTC 培养成功率，尤其是在关键的早期扩增阶段。

通过克隆培养解决异质性问题

众所周知，CTC 群体具有异质性，其中的细胞具有不同的转移潜能、药物敏感性和增殖能力。对混合的 CTC 群体进行大量培养可能会让快速生长的克隆占据主导地位，从而失去了使 CTC 具有临床意义的多样性。单细胞分离后再进行克隆扩增，可以保留这种异质性，从而确定单个 CTC 亚群的特征。微操作、荧光激活细胞分选（FACS）或微流控单细胞分装技术可将单个 CTC 分离到单独的孔中。这种方法虽然技术要求高，而且需要耐心，因为单细胞会慢慢建立克隆，但它能揭示患者 CTC 群体的真正多样性，并识别具有不同功能特性的亚群。

优化 CTC 生长培养基

没有通用的 CTC 培养基，因为不同癌症类型和患者对 CTC 的要求各不相同。许多研究小组首先使用针对来源相似的已建癌症细胞系进行优化的培养基（如用于乳腺癌 CTC 的 RPMI，用于肺癌 CTC 的 DMEM），然后补充额外的生长因子，包括 EGF、FGF、胰岛素等。一些方案添加了干细胞培养基成分，如 B27 或 N2 补充剂，假设具有类干细胞特性的 CTC 可能需要类似的支持。血清浓度是另一个变量：有些方案使用高血清（15-20%）以获得最大的生长支持，而另一些方案则使用明确的无血清配方以获得更好的控制。对每个患者样本进行经验优化可能是必要的，但由于起始材料有限，这具有挑战性。

扩增过程中的监测和表征

随着 CTC 培养物的扩增，持续监测可确保培养细胞保持 CTC 特性，且未被污染物过度生长。上皮标志物（细胞角蛋白、EpCAM）、与肿瘤类型相关的癌症标志物（乳腺癌的 ER/PR、前列腺癌的 PSA）的免疫染色以及白细胞标志物（CD45）的缺失都能确认其特征。通过短串联重复 (STR) 分析、核型分析或靶向测序进行基因鉴定，可验证培养细胞是否与患者的肿瘤基因型相匹配。评估致瘤特性、药物反应或侵袭能力的功能测试表明，培养的 CTC 保持着与生物相关的表型。鉴于基于 CTC 培养的临床决策事关重大，这种持续的特征描述至关重要。

成功率和预测因素

CTC 培养的成功率仍然很低，通常为尝试的 1-10%，但这因癌症类型、疾病分期和方法而有很大差异。CTC 数量多的转移性患者比 CTC 数量少的患者成功率更高。某些癌症类型似乎更适合培养--乳腺癌、前列腺癌和小细胞肺癌的 CTC 培养比其他癌症更频繁。技术因素也很重要：更温和的分离方法、快速处理、优化的培养条件和经验丰富的操作人员都能提高结果。随着该领域的成熟和方法的标准化，成功率应该会提高，但鉴于 CTC 细胞本身的应激状态，CTC 培养可能仍将面临挑战。

CTC 衍生的外植体模型

CTC 衍生外植体（CDX）模型是传统体外培养的一种替代方法，将 CTC 注入免疫功能低下的小鼠体内进行体内扩增。动物微环境提供的生长因子、基质和三维结构可能比人工培养条件更有利于 CTC 的存活。一旦在小鼠体内形成肿瘤，就可以在体外进行收获和再培养，或在动物体内进行连续传代。虽然这种方法规避了一些培养难题，但也带来了其他难题：费用、时间、动物设施要求以及可能改变 CTC 特性的小鼠环境潜在选择压力。尽管如此，CDX 模型已被证明在直接培养失败时很有价值，可为下游应用提供可扩展的材料。

精准肿瘤学中的应用

CTC 培养的最终目标是实现精准医学应用。对患者培养的 CTC 进行功能性药物测试，可指导治疗选择，确定有效疗法，避免无用的毒性治疗。由于 CTC 代表了实时肿瘤生物学，因此与多年前存档的原发肿瘤样本相比，它们能更好地反映当前的药物敏感性。对培养的 CTC 进行机理研究，可以揭示抗药性机制、转移特性和新的治疗靶点。CTC 衍生培养物的生物库为研究建立了与患者匹配的癌症模型库。然而，要实现这些应用，需要克服当前的技术限制，并验证培养的 CTC 能准确代表患者的疾病。

用于 CTC 培养的微流控平台

微流控设备可精确控制与单细胞或小集群相匹配的微环境，为 CTC 培养提供了独特的优势。这些平台可以创建营养梯度，提供精确的因子浓度，保持层流以进行持续的营养交换，并结合生物传感器进行实时监测。有些设备将捕获和培养集成在一个系统中，最大程度地减少了细胞在转移过程中的损失。兼容成像技术的设备可持续观察 CTC 的行为、增殖和形态。虽然微流控方法大有可为，但它们需要专业设备和专业知识，限制了其广泛应用。随着这些技术的成熟和普及，它们可能会成为 CTC 培养的标准工具。

质量控制和污染预防

由于 CTC 极其罕见，血细胞或其他类型细胞的污染很容易使培养物不堪重负。严格的无菌技术和及早发现污染至关重要。定期进行显微镜检查可识别形态各异的污染物。流式细胞术或免疫染色法检测细胞系标记（白细胞为 CD45，内皮细胞为 CD31），可发现非上皮细胞。如果能及早发现污染，选择性培养基或免疫磁性去除可能会挽救培养物。预防胜于治疗：在培养前对血细胞进行免疫耗竭、选择性培养基配方以及通过单细胞分离进行克隆纯化都能降低污染风险。这些严格的质量措施增加了复杂性，但考虑到 CTC 样品的珍贵性，这些措施是必要的。

标准化细胞系的作用

虽然 CTC 培养的重点是患者样本，但来自 Cytion 的标准化细胞和细胞系也发挥着重要的辅助作用。成熟的癌症细胞系可作为分离技术的阳性对照，在将方法应用于珍贵的患者样本之前进行验证和优化。它们为 CTC 培养提供条件培养基支持。它们与血液样本混合，可为方法开发和培训提供人工 CTC 加标样本。一些研究人员使用已建立的品系作为替代模型，测试可能有益于实际 CTC 的培养条件或培养基配方。这些标准化工具虽然不能取代患者来源的 CTC，但能加快方法开发，确保整个工作流程的质量控制。

新兴技术和未来方向

一些新兴方法可提高 CTC 培养的成功率。结合多种细胞类型的片上器官系统能更完整地模拟肿瘤微环境。提供可控灌注的生物反应器可支持少量细胞的长期培养。具有可调机械和生化特性的先进生物材料可优化物理培养环境。对早期培养参数的机器学习分析可预测成功的扩增，从而将资源集中用于有前景的样本。在培养前进行单细胞多组学表征，可以筛选出最有可能生长的 CTC。基于 CRISPR 的工程技术可在不影响临床相关性的前提下提高 CTC 的存活率。随着这些技术的融合，CTC 培养应该会越来越常规化，最终实现其精准癌症医学的承诺。