Publié : 2023 | Dernière mise à jour : mai 2026
Guide complet sur la congélation des cellules : garantir la viabilité et la stérilité
La congélation des cellules est un processus essentiel dans la gestion des cultures cellulaires, qui permet le stockage et la conservation à long terme de lignées cellulaires précieuses. Que l’on travaille avec des cellules humaines ou animales, il est primordial de suivre des protocoles précis et de respecter rigoureusement les techniques d’asepsie pour réussir la cryoconservation.
Ce guide fournit des instructions détaillées sur le matériel et les réactifs nécessaires, ainsi que sur les procédures étape par étape permettant de congeler efficacement les cellules tout en préservant leur viabilité et leur stérilité. En respectant ces lignes directrices, les chercheurs peuvent stocker en toute confiance leurs cultures cellulaires et les réactiver ultérieurement avec une perte minimale de viabilité cellulaire, ce qui permet de maintenir l’intégrité et la fiabilité de leurs résultats expérimentaux.
Pour commencer, il est essentiel de mettre en place un environnement de travail stérile. Des techniques d’asepsie appropriées jouent un rôle crucial dans la prévention de la contamination et la garantie de la stérilité des cultures.
Technique aseptique
Respectez les techniques d’asepsie tout au long du processus afin de garantir la stérilité des cultures.
Processus complet de congélation des cellules
Cet organigramme fournit un guide visuel détaillé des étapes essentielles à suivre pour une congélation adéquate des cellules. Suivez ces procédures pour garantir une viabilité et une intégrité élevées des cellules pendant le processus de cryoconservation.
Préparation du milieu de congélation
Préparez le milieu de congélation cryoprotecteur en fonction du type de cellules :
- Cultures en milieu contenant du FBS : 90 % de FBS + 10 % de DMSO ou 70 % de milieu de croissance, 20 % de FBS et 10 % de DMSO
- Cellules nécessitant du glycérol : 90 % de FBS + 10 % de glycérol
Envisagez de vous procurer notre milieu de congélation préformulé :
- Milieu de congélation CM-1 : pour les protocoles nécessitant un milieu contenant du sérum fœtal bovin (FBS)
- Milieu de congélation CM-ACF – sans sérum : pour une alternative sans FBS
Étiquetage et documentation
Étiquetez les cryotubes en y indiquant les renseignements suivants :
- Date
- Nom du chercheur
- Numéro de cellule
- Numéro de passage
- Type de cellule
- Toute information supplémentaire (p. ex., modifications génétiques)
Préparation des cellules
Pour les cellules adhérentes :
- Surveiller les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence de 85 à 95 %
- Aspirer l’ancien milieu de culture
- Rincer la monocouche cellulaire avec du PBS exempt de calcium et de magnésium
- Détachez les cellules à l’aide d’Accutase, de trypsine ou de trypsine-EDTA, puis neutralisez-les avec du milieu de culture si nécessaire
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube Falcon de 50 mL
Pour les cellules en suspension :
- Vérifier la densité et l’état des cellules au microscope
- Transférez la suspension cellulaire directement dans un tube Falcon de 50 mL
Comptage cellulaire et centrifugation
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé
- Centrifuger à 300 g pendant 3 à 5 minutes à température ambiante pour obtenir un culot cellulaire
- Aspirer soigneusement le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot cellulaire
- Réchauffez le milieu de congélation préparé à 37 °C avant utilisation
Cryoconservation
- Remettre le culot cellulaire en suspension dans le milieu de congélation à une densité de 2,0 millions de cellules/mL pour les cellules adhérentes et de 5 millions de cellules/mL pour les cellules en suspension, ou à la concentration souhaitée
- Répartir 1,0 mL (ou plus si nécessaire) de la suspension cellulaire dans des cryotubes étiquetés
- Utilisez une méthode de congélation lente avant de transférer les cellules vers un entreposage à long terme
- ? Méthode
- ? Étapes
-
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Congélation manuelle -
1️⃣ Placer les cellules dans le milieu de congélation dans un congélateur à 4 °C pendant 40 minutes.
2️⃣ Transférer dans un congélateur à -80 °C pendant 24 heures.
3️⃣ Conserver les cellules dans de l’azote liquide pour une conservation à long terme. -
?
Utilisation de Mr. Frosty -
1️⃣ Préparez les cellules dans des cryotubes contenant un milieu de congélation.
2️⃣ Placez les cryotubes dans le conteneur Mr. Frosty.
3️⃣ Conservez-les à -80 °C pendant 24 heures avant de les transférer dans de l’azote liquide. -
?
Congélateur à vitesse de congélation contrôlée -
1️⃣ Programmez l’appareil pour qu’il abaisse progressivement la température.
2️⃣ Placez les cellules préparées dans le congélateur.
3️⃣ Une fois le cycle de congélation terminé, transférez les cellules dans l’azote liquide.
- Conservez les cryotubes à des températures inférieures à -130 °C ou dans de l’azote liquide pour une conservation à long terme.
Matériel et réactifs
- Cryotubes de 1 à 2 mL
- Unité de congélation CoolCell® ou congélateur à vitesse contrôlée
- Milieu de congélation cryoprotecteur (p. ex., milieu cryoprotecteur maison, CM-1, CM-ACF ou milieux spécialisés)
- Sérum fœtal bovin (FBS) ou milieux conditionnés
- DMSO ou glycérol
- PBS sans calcium ni magnésium
- Accutase, trypsine ou trypsine-EDTA (pour les cellules adhérentes)
- Tubes Falcon de 15 mL ou 50 mL
- Hémocytomètre ou compteur cellulaire automatisé
- Centrifugeuse