Celice HaCaT

1. Zavrzite star medij: Iz bučk previdno odstranite staro gojišče.
2. Izperite celice: V erlenmajerice T25 dodajte 3-5 ml s fosfatom puferirane fiziološke raztopine (PBS) brez kalcija in magnezija, v erlenmajerice T75 pa 5-10 ml, da sperete prilepljene celice.
3. Dodajte raztopino EDTA: Celično plast v celoti prekrijte s sveže pripravljeno 0,05-odstotno raztopino EDTA. Uporabite 1-2 ml za bučke T25 in 2,5 ml za bučke T75.
4. Inkubirajte: Bučke inkubirajte pri 37 °C 10 minut.
5. Dodajte tripsin/EDTA ali raztopino TrypLE Express: Po inkubaciji v bučke dodajte sveže pripravljeno raztopino tripsina/EDTA (0,05 % tripsin, 0,025 % EDTA) ali raztopino TrypLE Express, tako da je plast celic popolnoma prekrita. Uporabite 1 ml za bučke T25 in 2,5 ml za bučke T75. (Opomba: Če uporabljate TrypLE Express, lahko izpustite 3. in 4. korak.)
6. Spremljajte ločevanje: Celice opazujte pod mikroskopom. Celice se morajo odcepiti v 1-5 minutah.
7. Nevtralizirajte tripsin: Takoj ko se celice odcepijo, dodajte gojišče za celične kulture, ki vsebuje fetalni goveji serum (FBS), da nevtralizirate aktivnost tripsina.
8. Prenesite celice: Celično suspenzijo prelijte v nove erlenmajerice, predhodno napolnjene s svežim gojiščem.

1. Prepričajte se, da je viala ob dostavi globoko zamrznjena, saj se celice pošiljajo na suhem ledu, da se med prevozom ohranijo optimalne temperature.

2. Po prejemu kriovial takoj shranite pri temperaturi pod -150 °C, da zagotovite ohranitev celične celovitosti, ali pa nadaljujte s korakom 3, če je potrebno takojšnje gojenje.

3. Za takojšnje gojenje vialo hitro odtalite tako, da jo potopite v vodno kopel s čisto vodo in protimikrobnim sredstvom pri 37 °C ter 40-60 sekund nežno mešate, dokler ne ostane majhen ledeni kepica.

4. Vse nadaljnje korake izvajajte v sterilnih pogojih v pretočni nape, pred odprtjem pa kriovial razkužite s 70 % etanolom.

5. Previdno odprite razkuženo vialo in celično suspenzijo prenesite v 15-mililitrsko centrifugirno epruveto, ki vsebuje 8 ml gojišča sobne temperature, ter nežno premešajte.

6. Mešanico centrifugirajte pri 300 x g 3 minute, da ločite celice, in previdno zavrzite supernatant, ki vsebuje ostanke zamrzovalnega gojišča.

7. Pelet celic nežno ponovno suspendirajte v 10 ml svežega gojišča. Pri adherentnih celicah suspenzijo razdelite med dve bučki T25; pri suspenzijskih kulturah prenesite vse gojišče v eno bučko T25, da spodbudite učinkovito interakcijo in rast celic.

8. Upoštevajte uveljavljene protokole subkultur za nadaljnjo rast in vzdrževanje celične linije ter tako zagotovite zanesljive rezultate poskusov.

37 °C, 5 %_CO2, vlažno ozračje.

Za optimalno pritrditev in sposobnost preživetja po odmrznitvi priporočamo uporabo s kolagenom prevlečenih bučk ali plošč.

Kriokonzervirane celične linije se pošiljajo na suhem ledu v potrjeni, izolirani embalaži z zadostno količino hladilnega sredstva, da se med prevozom vzdržuje približno -78 °C. Ob prejemu takoj preglejte embalažo in viale nemudoma prenesite v ustrezno skladišče.

Kriokonzervirane celične linije se pošiljajo na suhem ledu v potrjeni, izolirani embalaži z zadostno količino hladilnega sredstva, da se med prevozom vzdržuje približno -78 °C. Ob prejemu takoj preglejte embalažo in viale nemudoma prenesite v ustrezno skladišče.

Za dolgotrajno shranjevanje viale postavite v tekoči dušik v parni fazi pri približno -150 do -196 °C. Shranjevanje pri -80 °C je sprejemljivo le kot kratek vmesni korak pred prenosom v tekoči dušik.

Kontaminacija z mikoplazmo se izključi z uporabo testov na podlagi PCR in metod za odkrivanje mikoplazme na podlagi luminiscence.

Da se zagotovi, da ni kontaminacije z bakterijami, glivami ali kvasovkami, se celične kulture dnevno vizualno pregledujejo.