HaCaT ląstelės

1. Išmeskite seną terpę: Iš kolbų atsargiai išimkite seną terpę.
2. Išplaukite ląsteles: Į T25 kolbas įpilkite 3-5 ml fosfatu buferizuoto fiziologinio tirpalo (PBS) be kalcio ir magnio, o į T75 kolbas - 5-10 ml, kad išplautumėte prilipusias ląsteles.
3. Įpilkite EDTA tirpalo: Ląstelių sluoksnį visiškai uždenkite šviežiai paruoštu 0,05 % EDTA tirpalu. Naudokite 1-2 ml T25 kolboms ir 2,5 ml T75 kolboms.
4. Inkubuoti: 10 minučių inkubuokite kolbas 37 °C temperatūroje.
5. Įpilkite tripsino/EDTA arba "TrypLE Express" tirpalo: Po inkubacijos į kolbas įpilkite šviežiai paruošto tripsino/EDTA tirpalo (0,05 % tripsino, 0,025 % EDTA) arba "TrypLE Express" tirpalo, kad ląstelių sluoksnis būtų visiškai padengtas. T25 kolboms naudokite 1 ml, o T75 kolboms - 2,5 ml. (Pastaba. 3 ir 4 žingsnių galima neatlikti, jei naudojate "TrypLE Express".)
6. Stebėkite atsiskyrimą: Stebėkite ląsteles mikroskopu. Ląstelės turėtų atsiskirti per 1-5 minutes.
7. Neutralizuokite tripsiną: Kai tik ląstelės atsiskiria, įpilkite ląstelių kultūros terpės, kurioje yra fetalinio galvijų serumo (FBS), kad neutralizuotumėte tripsino aktyvumą.
8. Perkelkite ląsteles: Ląstelių suspensiją išpilstykite į naujas kolbas, iš anksto pripildytas šviežios terpės.

1. Patikrinkite, ar pristatant buteliuką jis išlieka gerai užšaldytas, nes ląstelės gabenamos ant sauso ledo, kad gabenimo metu būtų palaikoma optimali temperatūra.

2. Gavę iš karto laikykite kriovialą žemesnėje nei -150 °C temperatūroje, kad užtikrintumėte ląstelių vientisumo išsaugojimą, arba pereikite prie 3 veiksmo, jei reikia nedelsiant kultivuoti.

3. Jei norite nedelsiant pradėti kultivuoti, greitai atšildykite buteliuką panardindami jį į 37 °C temperatūros vandens vonelę su švariu vandeniu ir antimikrobine priemone, švelniai maišydami 40-60 sekundžių, kol liks nedidelis ledo gabalėlis.

4. Visus tolesnius veiksmus atlikite steriliomis sąlygomis srauto gaubte, prieš atidarydami kriovialą dezinfekuokite jį 70 % etanoliu.

5. Atsargiai atidarykite dezinfekuotą buteliuką ir perpilkite ląstelių suspensiją į 15 ml centrifugos mėgintuvėlį, kuriame yra 8 ml kambario temperatūros mitybinės terpės, atsargiai išmaišykite.

6. Mišinį centrifuguokite 300 x g greičiu 3 minutes, kad atsiskirtų ląstelės, ir atsargiai išmeskite supernatantą su šaldymo terpės likučiais.

7. Švelniai resuspenduokite ląstelių granules 10 ml šviežios mitybinės terpės. Jei ląstelės yra prigludusios, suspensiją padalykite į dvi T25 kolbas; jei tai suspensinės kultūros, visą terpę perkelkite į vieną T25 kolbą, kad paskatintumėte veiksmingą ląstelių sąveiką ir augimą.

8. Laikykitės nustatytų subkultūrų protokolų, kad ląstelių linija nuolat augtų ir būtų palaikoma, taip užtikrinant patikimus eksperimentų rezultatus.

37 °C, 5 %_CO2, drėkintoje atmosferoje.

Kad po atšildymo būtų užtikrintas optimalus prisitvirtinimas ir gyvybingumas, rekomenduojame naudoti kolagenu dengtas kolbas arba plokšteles.

Kriokonservuotos ląstelių linijos gabenamos ant sauso ledo patvirtintoje, izoliuotoje pakuotėje su pakankamu kiekiu šaldymo skysčio, kad pervežimo metu būtų palaikoma maždaug -78 °C temperatūra. Gavę pakuotę, nedelsdami ją apžiūrėkite ir nedelsdami perkelkite mėgintuvėlius į tinkamą saugyklą.

Kriokonservuotos ląstelių linijos gabenamos ant sauso ledo patvirtintoje, izoliuotoje pakuotėje su pakankamu kiekiu šaldymo skysčio, kad pervežimo metu būtų palaikoma maždaug -78 °C temperatūra. Gavę pakuotę, nedelsdami ją apžiūrėkite ir nedelsdami perkelkite mėgintuvėlius į tinkamą saugyklą.

Norėdami ilgai saugoti, įdėkite buteliukus į garų fazės skystą azotą maždaug -150-196 °C temperatūroje. Laikymas -80 °C temperatūroje yra priimtinas tik kaip trumpas tarpinis etapas prieš perkeliant į skystąjį azotą.

Mikoplazmos užterštumas atmetamas taikant PGR pagrįstus tyrimus ir liuminescencinius mikoplazmos aptikimo metodus.

Siekiant užtikrinti, kad nebūtų užteršimo bakterijomis, grybeliais ar mielėmis, ląstelių kultūros kasdien vizualiai tikrinamos.