עבור לדף הבית
עגלת קניות ‏0.00 ‏€*
הצג את כל הקטגוריות פלטפורמות סינון GPCR מבוססות תאי HEK בעלות תפוקה גבוהה חזרה

פלטפורמות סינון GPCR מבוססות תאי HEK

קולטנים המצומדים לחלבון G (GPCR) מהווים את המשפחה הגדולה ביותר של חלבוני ממברנה בגנום האנושי ומהווים כ-34% מכלל המטרות התרופתיות. ב-Cytion, אנו מבינים כי פיתוח טיפולים יעילים המכוונים ל-GPCR דורש פלטפורמות סינון מבוססות תאים חזקות, המסוגלות למדוד במדויק את הפעלת הקולטנים באלפי עד מיליוני תרכובות. תאי HEK293 התגלו כפונדקאים המועדפים לביטוי GPCR ולסינון תפקודי, ומציעים שילוב ייחודי של ביטוי קולטנים יעיל, רקע קולטנים אנדוגני נמוך ותאימות עם פורמטים שונים של בדיקות.

נקודות מרכזיות

  • תאי HEK293 מספקים רקע אידיאלי לביטוי GPCR הטרוגני עם הפרעה מינימלית מקולטנים אנדוגניים
  • פורמטים מרובים של בדיקות — זרימת סידן, cAMP, גיוס β-arrestin — מאפשרים חקירה מקיפה של המסלול
  • טיפול נוזלי אוטומטי וקוראי צלחות מאפשרים תפוקת סינון העולה על 100,000 תרכובות ביום
  • אסטרטגיות לפיתוח קווי תאים יציבים מאזנות בין דרישות התפוקה לבין עקביות הבדיקה
  • זיהוי אגוניזם מוטה דורש קריאות מרובות על פני שרשראות איתות שונות
פלטפורמת סינון תפוקה גבוהה מבוססת HEK293-GPCR מסלולי איתות GPCR GPCR Gαs ↑cAMP Gαq ↑Ca²⁺ β-arr Recruit טכנולוגיות בדיקה זרימת סידן Fluo-4/Fura-2 FLIPR/קורא צלחות בדיקות cAMP HTRF/AlphaScreen GloSensor β-Arrestin PathHunter BRET/NanoBiT גן מדווח CRE-Luc NFAT-לוק זרימת עבודה HTS זריעת תאים 384/1536-well תרכובת תוספת זיהוי קריאה ניתוח בחירת תוצאות HEK293 יתרונות עבור סינון GPCR רקע נמוך אנדוגני מינימלי ביטוי GPCR אות/רעש נקי ביטוי גבוה טרנספקציה יעילה מקדם CMV חזק 10⁵-10⁶ קולטנים/תא איתות מלא כל תתי-סוגי חלבון G חלבוני מתאם קיימים צימוד מסלול טבעי תואם לבדיקה עמיד במיקרו-פלטה התאמה לתמיסה עיבוד אוטומטי מדדי תפוקה של סינון פורמט בארות/צלחת תרכובות/יום 96 96 5,000-10,000 384-באר 384 20,000-50,000 1536-well 1536 100,000-500,000 3456-well 3456 500,000-1,000,000 פיתוח קו תאים יציב 1. תכנון וקטור עם סמן בחירה 2. טרנספקציה של תאי אב HEK293 3. בחירת אנטיביוטיקה (2-4 שבועות) 4. שיבוט תאים בודדים (FACS/דילול מגביל) 5. סינון שיבוטים לצורך ביטוי/תפקוד 6. בנק תאים ובדיקת יציבות לוח זמנים: 3-6 חודשים © Cytion - מאפשרים גילוי תרופות GPCR

מדוע תאי HEK293 מצטיינים בסינון GPCR

תאי HEK293 הפכו לסטנדרט דה פקטו לבדיקות תפקודיות של GPCR בשל מספר יתרונות מהותיים. ראשית, הביטוי האנדוגני הנמוך יחסית של GPCR בתאים אלה ממזער את האותות ברקע העלולים לבלבל מחקרים על קולטנים הטרוגניים. בניגוד לקווי תאים מסוימים שמקורם בסרטן, המבטאים GPCR רבים ברמות רלוונטיות מבחינה תפקודית, תאי HEK293 מספקים קנבס נקי לביטוי קולטנים.

שנית, תאי HEK293 מבטאים את כל תת-הסוגים העיקריים של חלבון G (Gαs, Gαi, Gαq, Gα12/13) ברמות מספיקות לתמיכה בצימוד קולטנים מגוון. רפרטואר איתותים מלא זה מאפשר חקירה של אינטראקציות בין קולטנים לחלבון G טבעיים, ללא צורך בביטוי משותף של יחידות משנה ספציפיות של חלבון G.

שלישית, תאי HEK293 מבצעים טרנספקציה ביעילות באמצעות מספר סוגים של ריאגנטים, ומשיגים שיעורי טרנספקציה העולים על 90%. יעילות זו מתורגמת לרמות ביטוי גבוהות של קולטנים — בדרך כלל 10⁵ עד 10⁶ קולטנים לכל תא — ומספקת חלונות איתות חזקים אפילו עבור קולטנים עם יעילות צימוד צנועה.

תאי HEK293T שלנו (300189) מציעים יעילות טרנספקציה גבוהה במיוחד לביטוי GPCR זמני, מה שהופך אותם לאידיאליים לאפיון ראשוני של קולטנים ופיתוח בדיקות לפני התחייבות ליצירת קו תאים יציב.

בחירת פורמט הבדיקה לסינון GPCR

בדיקות זרימת סידן: קולטנים המצומדים ל-Gαq מפעילים פוספוליפאז C, מה שמעורר שחרור סידן ממאגרים תאיים. צבעים פלואורסצנטיים רגישים לסידן כגון Fluo-4, Fura-2 או אינדיקטורים גנטיים לסידן מאפשרים מדידה בזמן אמת של תגובה זו. קוראי פלואורסצנציה מבוססי צלחת כגון FLIPR יכולים למדוד בו-זמנית מעברים של סידן על פני צלחות שלמות של 384 או 1536 בארות, ולהשיג תפוקה העולה על 100,000 נקודות נתונים ביום.

בדיקות cAMP: קולטנים המצומדים ל-Gαs מגרים אדניל ציקלאז, מה שמגביר את רמת ה-cAMP התוך-תאית, בעוד שקולטנים המצומדים ל-Gαi מעכבים את ייצור ה-cAMP. טכנולוגיות בדיקה מרובות מזהות שינויים ב-cAMP, כולל בדיקות אימונולוגיות תחרותיות (HTRF, AlphaScreen), גישות מבוססות ביוסנסורים (GloSensor) ובדיקות גנים מדווחים (CRE-luciferase). כל אחת מהן מציעה יתרונות ייחודיים ברגישות, קינטיקה ותפוקה.

גיוס β-Arrestin: הפעלת GPCR מפעילה גיוס β-arrestin לקולטן, תהליך הניתן למדידה באמצעות בדיקות השלמת חלבונים. טכנולוגיות כמו PathHunter (השלמת שברי אנזימים) ו-NanoBiT (לוקיפרז מפוצל) מספקות תוצאות רגישות, בלתי תלויות במסלול, הניתנות ליישום בכל סוגי הקולטנים, ללא תלות בהעדפת הצימוד של חלבון G.

בדיקות גנים מדווחים: מערכות מדווחים טרנסקריפציונליים מודדות אירועי איתות במורד הזרם, ומספקות הגברה המשפרת את הרגישות. מדווחי CRE-לוציראז מזהים הפעלת מסלול cAMP, NFAT-לוציראז מגיב לאיתות סידן, ו-SRE-לוציראז מנטר מסלולים מרובים. אף על פי שהן איטיות יותר ממדידות ישירות של שליחים משניים, בדיקות מדווחים מספקות יחסי אות לרעש מצוינים.

אסטרטגיות לפיתוח קווי תאים יציבים

קמפיינים של סינון בתפוקה גבוהה דורשים בדרך כלל קווי תאים יציבים המבטאים את ה-GPCR היעד ברמות עקביות במיליארדי תאי בדיקה. פיתוח קו יציב מתחיל בעיצוב וקטור המשלב הן את הקולטן והן סמן בר-בחירה, המאפשר העשרה של תאים שעברו טרנספקציה יציבה.

תאי HEK293 (300192) שלנו משמשים כקו הורי סטנדרטי ליצירת קווי תאים יציבים. לאחר טרנספקציה ובחירת אנטיביוטיקה (בדרך כלל 2-4 שבועות), התאים ששרדו עוברים שיבוט תאים בודדים באמצעות דילול מוגבל או מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS). לאחר מכן, השיבוטים הבודדים מורחבים ומאופיינים לפי רמת ביטוי הקולטן, עוצמת התגובה התפקודית וחוזק הבדיקה.

תכונות איכות קריטיות לסינון קווי תאים כוללות יציבות ביטוי לאורך מעברים ממושכים, פרמקולוגיה עקבית בהשוואה לסטנדרטים התייחסותיים וביצועים חזקים בפורמטים של צלחות ממוזערות. יש להקים מאגרי תאים מוסמכים בשלב מוקדם של קמפיין הסינון כדי להבטיח ביצועים עקביים לאורך כל הדרך.

לצורך קיצור לוחות הזמנים, תאי HEK293 EBNA (300264) שלנו מאפשרים ביטוי יציב מווקטורים אפיסומליים, מה שעשוי לקצר את לוחות הזמנים לפיתוח תוך שמירה על עקביות הביטוי.

שיקולים בנוגע למיזעור ואוטומציה

מיקסום תפוקת הסינון מחייב מיניאטוריזציה לפורמטים של 384, 1536 או אפילו 3456 תאים. תאי HEK293 מסתגלים היטב לריבוי תאים בצפיפות גבוהה בנפחים מצומצמים, אם כי ייתכן שיהיה צורך לבצע אופטימיזציה של צפיפות התאים, תנאי הריבוי וזמני הדגירה עבור כל מעבר בין פורמטים.

תאי HEK293 המותאמים לתמיסה מציעים יתרונות עבור תהליכי סינון אוטומטיים. תאי HEK293 המותאמים לתמיסה (300686) שלנו ניתנים להזרקה ישירות מכלי התרבית לצלחות הבדיקה ללא טריפסין, מה שמצמצם את שלבי הטיפול ומשפר את העקביות. תאימות זו עם מעבדי נוזלים אוטומטיים מאפשרת ביצוע קמפיינים של סינון ללא התערבות אנושית.

דרישות היציבות של צלחות הבדיקה משתנות בהתאם לפורמט. בדיקות זרימת סידן דורשות בדרך כלל מדידה בתוך שעות ספורות לאחר העמסת הצבע, בעוד שבדיקות cAMP ו-β-arrestin עשויות לאפשר אינקובציה בן לילה לפני הקריאה. הבנת אילוצים אלה מסייעת בתכנון הלוגיסטיקה של הסינון ותזמון הציוד.

ניתוח נתונים וזיהוי תוצאות

קמפיינים של סינון GPCR מייצרים מאגרי נתונים עצומים הדורשים צינורות ניתוח חזקים. פרמטרים סטטיסטיים, כולל גורם Z', יחס אות לרעש וקוויariation, מעריכים את איכות הבדיקה על בסיס כל צלחת בנפרד. צלחות שאינן עומדות בספי האיכות צריכות להיבדק מחדש ולא להילקח בחשבון.

קריטריוני זיהוי התוצאות מאזנים בין רגישות לבין שיעורי תוצאות חיוביות כוזבות. ספי פעילות של 50% הפעלה או עיכוב ביחס לתרכובות ייחוס מספקים נקודות התחלה סבירות, אם כי הספים האופטימליים תלויים בהרכב הספרייה ובמטרות התוכנית. אישור ריכוז-תגובה של תוצאות ראשוניות מבטל תוצרים מלאכותיים ומדרג את התרכובות לצורך מעקב.

גילוי תרופות GPCR מודרני מדגיש יותר ויותר אגוניזם מוטה — תרכובות המעדיפות להפעיל מסלולי איתות מסוימים על פני אחרים. זיהוי תרכובות מוטות דורש בדיקות מקבילות המודדות מסלולים מרובים (למשל, הפעלת חלבון G לעומת גיוס β-arrestin) תוך הקפדה על רגישות הבדיקה וקינטיקה כדי למנוע הטיה טכנית.

מוצרים מומלצים לסינון GPCR:

אתר זה משתמש בעוגיות כדי להבטיח שתקבל את החוויה הטובה ביותר באתר שלנו... מידע נוסף.
- Imprint

אנו מזהים שאתה נמצא במדינה אחרת או משתמש בשפת דפדפן שונה מזו שנבחרה כרגע. האם ברצונך לקבל את ההגדרות המוצעות?

סגור