Κύτταρα HaCaT

1. Απορρίψτε το παλιό μέσο: Αφαιρέστε προσεκτικά το παλιό μέσο καλλιέργειας από τις φιάλες.
2. Πλύνετε τα κύτταρα: Προσθέστε 3-5 ml φυσιολογικού ορού ρυθμισμένου με φωσφορικά άλατα (PBS) χωρίς ασβέστιο και μαγνήσιο σε φιάλες T25 ή 5-10 ml σε φιάλες T75 για να ξεπλύνετε τα προσκολλημένα κύτταρα.
3. Προσθέστε διάλυμα EDTA: Καλύψτε πλήρως τη στιβάδα των κυττάρων με ένα φρεσκοπαρασκευασμένο διάλυμα EDTA 0,05%. Χρησιμοποιήστε 1-2 ml για φιάλες T25 και 2,5 ml για φιάλες T75.
4. Επώαση: Επωάστε τις φιάλες στους 37°C για 10 λεπτά.
5. Προσθέστε διάλυμα Trypsin/EDTA ή TrypLE Express: Μετά την επώαση, προσθέστε ένα φρεσκοπαρασκευασμένο διάλυμα τρυψίνης/EDTA (0,05% τρυψίνη, 0,025% EDTA) ή TrypLE Express στις φιάλες, εξασφαλίζοντας ότι η κυτταρική στιβάδα καλύπτεται πλήρως. Χρησιμοποιήστε 1 ml για φιάλες T25 και 2,5 ml για φιάλες T75. (Σημείωση: Τα βήματα 3 και 4 μπορούν να παραλειφθούν εάν χρησιμοποιείται το TrypLE Express)
6. Παρακολούθηση της αποκόλλησης: Παρατηρήστε τα κύτταρα στο μικροσκόπιο. Τα κύτταρα θα πρέπει να αποκολληθούν εντός 1-5 λεπτών.
7. Εξουδετέρωση της τρυψίνης: Προσθέστε μέσο κυτταροκαλλιέργειας που περιέχει εμβρυϊκό ορό βοοειδών (FBS) για την εξουδετέρωση της δραστικότητας της θρυψίνης μόλις τα κύτταρα αποκολληθούν.
8. Μεταφορά κυττάρων: Διανείμετε το εναιώρημα κυττάρων σε νέες φιάλες προγεμισμένες με φρέσκο μέσο καλλιέργειας.

1. Επιβεβαιώστε ότι το φιαλίδιο παραμένει βαθιά παγωμένο κατά την παράδοση, καθώς τα κύτταρα αποστέλλονται σε ξηρό πάγο για να διατηρούνται οι βέλτιστες θερμοκρασίες κατά τη μεταφορά.

2. Κατά την παραλαβή, είτε αποθηκεύστε το κρυοφιαλίδιο αμέσως σε θερμοκρασίες κάτω των -150°C για να διασφαλίσετε τη διατήρηση της κυτταρικής ακεραιότητας, είτε προχωρήστε στο βήμα 3 εάν απαιτείται άμεση καλλιέργεια.

3. Για άμεση καλλιέργεια, αποψύξτε γρήγορα το φιαλίδιο βυθίζοντάς το σε υδατόλουτρο 37°C με καθαρό νερό και αντιμικροβιακό παράγοντα, αναδεύοντας απαλά για 40-60 δευτερόλεπτα μέχρι να παραμείνει ένα μικρό σβόλο πάγου.

4. Εκτελέστε όλα τα επόμενα βήματα υπό αποστειρωμένες συνθήκες σε απορροφητήρα ροής, απολυμαίνοντας το κρυοφιαλίδιο με 70% αιθανόλη πριν από το άνοιγμα.

5. Ανοίξτε προσεκτικά το απολυμασμένο φιαλίδιο και μεταφέρετε το εναιώρημα των κυττάρων σε ένα σωληνάριο φυγοκέντρησης των 15 ml που περιέχει 8 ml θρεπτικού μέσου καλλιέργειας σε θερμοκρασία δωματίου, αναμειγνύοντας απαλά.

6. Φυγοκεντρίστε το μείγμα στα 300 x g για 3 λεπτά για να διαχωριστούν τα κύτταρα και απορρίψτε προσεκτικά το υπερκείμενο που περιέχει το υπόλοιπο μέσο κατάψυξης.

7. Επανασυσσωματώστε απαλά το κυτταρικό σφαιρίδιο σε 10 ml φρέσκου μέσου καλλιέργειας. Για προσκολλημένα κύτταρα, μοιράστε το εναιώρημα σε δύο φιάλες καλλιέργειας T25- για καλλιέργειες εναιωρήματος, μεταφέρετε όλο το μέσο σε μία φιάλη T25 για να προωθήσετε την αποτελεσματική αλληλεπίδραση και ανάπτυξη των κυττάρων.

8. Τηρείτε τα καθιερωμένα πρωτόκολλα υποκαλλιέργειας για τη συνεχή ανάπτυξη και διατήρηση της κυτταρικής σειράς, εξασφαλίζοντας αξιόπιστα πειραματικά αποτελέσματα.

37°C, 5%_CO2, υγροποιημένη ατμόσφαιρα.

Για βέλτιστη προσκόλληση και βιωσιμότητα μετά την απόψυξη, συνιστούμε τη χρήση φιαλών ή πλακών με επικάλυψη κολλαγόνου.

Οι κρυοσυντηρημένες κυτταρικές σειρές αποστέλλονται σε ξηρό πάγο σε επικυρωμένη, μονωμένη συσκευασία με επαρκές ψυκτικό μέσο για τη διατήρηση περίπου των -78 °C καθ' όλη τη διάρκεια της μεταφοράς. Κατά την παραλαβή, επιθεωρήστε αμέσως τον περιέκτη και μεταφέρετε τα φιαλίδια χωρίς καθυστέρηση στην κατάλληλη αποθήκη.

Οι κρυοσυντηρημένες κυτταρικές σειρές αποστέλλονται σε ξηρό πάγο σε επικυρωμένη, μονωμένη συσκευασία με επαρκές ψυκτικό μέσο για τη διατήρηση περίπου των -78 °C καθ' όλη τη διάρκεια της μεταφοράς. Κατά την παραλαβή, επιθεωρήστε αμέσως τον περιέκτη και μεταφέρετε τα φιαλίδια χωρίς καθυστέρηση στην κατάλληλη αποθήκη.

Για μακροχρόνια συντήρηση, τοποθετήστε τα φιαλίδια σε υγρό άζωτο σε φάση ατμών σε θερμοκρασία περίπου -150 έως -196 °C. Η αποθήκευση στους -80 °C είναι αποδεκτή μόνο ως σύντομο ενδιάμεσο βήμα πριν από τη μεταφορά σε υγρό άζωτο.

Η μόλυνση από μυκόπλασμα αποκλείεται με τη χρήση τόσο των δοκιμασιών που βασίζονται στην PCR όσο και των μεθόδων ανίχνευσης μυκοπλάσματος με βάση τη φωταύγεια.

Για να διασφαλιστεί ότι δεν υπάρχει μόλυνση από βακτήρια, μύκητες ή ζύμες, οι κυτταροκαλλιέργειες υποβάλλονται σε καθημερινές οπτικές επιθεωρήσεις.