Celule HaCaT

1. Aruncați mediul vechi: Îndepărtați cu grijă mediul de cultură vechi din flacoane.
2. Spălarea celulelor: Se adaugă 3-5 ml de soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) fără calciu și magneziu la flacoanele T25 sau 5-10 ml la flacoanele T75, pentru a spăla celulele aderente.
3. Se adaugă soluția EDTA: Acoperiți stratul de celule în întregime cu o soluție de EDTA 0,05% proaspăt preparată. Se utilizează 1-2 ml pentru flacoane T25 și 2,5 ml pentru flacoane T75.
4. Incubare: Incubați flacoanele la 37°C timp de 10 minute.
5. Se adaugă soluția Trypsin/EDTA sau TrypLE Express: După incubare, adăugați o soluție de tripsină/EDTA proaspăt preparată (0,05% tripsină, 0,025% EDTA) sau TrypLE Express în flacoane, asigurându-vă că stratul celular este complet acoperit. Se utilizează 1 ml pentru flacoane T25 și 2,5 ml pentru flacoane T75. (Notă: Etapele 3 și 4 pot fi omise dacă se utilizează TrypLE Express)
6. Monitorizați detașarea: Observați celulele la microscop. Celulele ar trebui să se desprindă în 1-5 minute.
7. Neutralizarea tripsinei: Adăugați mediu de cultură celulară conținând ser fetal bovin (FBS) pentru a neutraliza activitatea tripsinei imediat ce celulele s-au detașat.
8. Se transferă celulele: Se distribuie suspensia celulară în flacoane noi preumplute cu mediu de cultură proaspăt.

1. Confirmați că flaconul rămâne profund înghețat la livrare, deoarece celulele sunt expediate pe gheață carbonică pentru a menține temperaturi optime în timpul transportului.

2. La primire, fie depozitați crioviola imediat la temperaturi sub -150 °C pentru a asigura păstrarea integrității celulare, fie treceți la etapa 3 dacă este necesară cultivarea imediată.

3. Pentru cultivarea imediată, dezghețați rapid flaconul prin scufundarea acestuia într-o baie de apă la 37 °C cu apă curată și un agent antimicrobian, agitându-l ușor timp de 40-60 de secunde până când rămâne o mică aglomerare de gheață.

4. Se efectuează toate etapele ulterioare în condiții sterile, într-o hotă cu flux, dezinfectând crioviola cu etanol 70% înainte de deschidere.

5. Se deschide cu grijă flaconul dezinfectat și se transferă suspensia celulară într-un tub de centrifugare de 15 ml care conține 8 ml de mediu de cultură la temperatura camerei, amestecând ușor.

6. Se centrifughează amestecul la 300 x g timp de 3 minute pentru a separa celulele și se aruncă cu grijă supernatantul care conține mediul de congelare rezidual.

7. Se resuspendă ușor peletul celular în 10 ml de mediu de cultură proaspăt. Pentru celulele aderente, împărțiți suspensia între două flacoane de cultură T25; pentru culturile în suspensie, transferați tot mediul într-un flacon T25 pentru a promova interacțiunea și creșterea celulară eficientă.

8. Respectați protocoalele de subcultură stabilite pentru creșterea și menținerea continuă a liniei celulare, asigurând rezultate experimentale fiabile.

37°C, 5%_CO2, atmosferă umidificată.

Pentru atașare optimă și viabilitate după decongelare, vă recomandăm să utilizați flacoane sau plăci acoperite cu colagen.

Liniile celulare crioconservate sunt expediate pe gheață carbonică în ambalaje izolate, validate, cu suficient agent frigorific pentru a menține aproximativ -78 °C pe toată durata transportului. La primire, se inspectează imediat recipientul și se transferă fără întârziere fiolele în depozitul corespunzător.

Liniile celulare crioconservate sunt expediate pe gheață carbonică în ambalaje izolate, validate, cu suficient agent frigorific pentru a menține aproximativ -78 °C pe toată durata transportului. La primire, se inspectează imediat recipientul și se transferă fără întârziere fiolele în depozitul corespunzător.

Pentru conservarea pe termen lung, flacoanele se plasează în azot lichid în fază de vapori la o temperatură cuprinsă între -150 și -196 °C. Păstrarea la -80 °C este acceptabilă doar ca o scurtă etapă intermediară înainte de transferul în azot lichid.

Contaminarea cu micoplasmă este exclusă utilizând atât teste bazate pe PCR, cât și metode de detectare a micoplasmei bazate pe luminescență.

Pentru a se asigura că nu există contaminare bacteriană, fungică sau de drojdie, culturile celulare sunt supuse unor inspecții vizuale zilnice.